結腸腺癌中Orai1與STIM1的表達及臨床意義

李艷東，朱 琳，周永莉，周 伊，鄭建云

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，結腸癌病死率位居惡性腫瘤的第2位[1]。由鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1, Orai1)和基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)為主要因子組成的鈣池調控鈣內流(store-operated calcium entry, SOCE)通道是鈣離子內流的主要途徑，已經被證明其參與許多腫瘤的發生及侵襲轉移，包括胃癌[2]、鼻咽癌[3]、前列腺癌[4]等。有關結腸癌中Orai1和STIM1表達的研究報道較少，本實驗通過檢測結腸腺癌中Orai1和STIM1蛋白的表達，分析兩者之間的關系，探討兩者表達與結腸癌侵襲、轉移及預后的關系。

1 材料與方法

1.1材料收集西安醫學院第一附屬醫院病理科2006年～2014年存檔的結腸腺癌石蠟標本80例及正常結腸黏膜標本50例。結腸腺癌病例根據《美國腫瘤聯合委員會癌癥分期手冊》(7版)相關組織學分型和臨床病理分期標準進行病理診斷。兔抗人Orai1抗體、兔抗人STIM1抗體均購自英國Abcam公司。

1.2免疫組化將收集的蠟塊切片行免疫組化SP法檢測，DAB顯色，蘇木精復染，操作嚴格按照說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3結果判定Orai1及STIM1蛋白以細胞質中出現淺黃色至棕褐色信號為陽性細胞。結果判讀采用二級計分法：(1)按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞所占百分比評分：陰性為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將兩項得分結果相乘：總分>4分為高表達，≤4分為低表達。

1.4統計學處理使用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學分析，分類計數資料的組間比較采用χ2檢驗，等級資料相關性采用Spearman等級相關分析，采用Kaplan-Meier法計算生存率，單因素生存率的比較采用Log-rank檢驗，多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Orai1在結腸腺癌及正常結腸黏膜中的表達Orai1在結腸腺癌中的表達定位于細胞質，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀物質(圖1)。Orai1在結腸腺癌中的高表達率為68.8%(55/80)，在正常結腸黏膜中的高表達率僅為28.0%(14/50)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2STIM1在結腸腺癌及正常結腸黏膜中的表達STIM1在結腸腺癌中的表達亦定位于細胞質，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀物質(圖2)。STIM1在結腸腺癌中的高表達率為61.3%(49/80)，而在正常結腸黏膜中的高表達率僅為24.0%(12/50)，STIM1在結腸腺癌中的表達顯著高于正常結腸黏膜(P<0.05，表1)。

表1 Orai1和STIM1在結腸腺癌及正常結腸黏膜中的表達

①②

圖1Orai1在結腸腺癌中的表達，SP法圖2STIM1在結腸腺癌中的表達，SP法

2.3Orai1、STIM1表達與結腸腺癌臨床病理特征的關系及兩者表達的相關性Orai1和STIM1在結腸腺癌中的表達均與TNM分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者性別、年齡及分化程度無關(P>0.05，表2)。Spearman等級相關性分析顯示，Orai1、STIM1蛋白在結腸腺癌中的表達呈顯著正相關(P=0.001，rs=0.349，表3)。

表2 Orai1和STIM1表達與結腸腺癌臨床病理特征的關系

表3 結腸腺癌中Orai1和STIM1表達的相關性

2.4Orai1與STIM1表達與結腸腺癌患者預后的關系Kaplan-Meier生存分析顯示，Orai1高表達組5年生存率(52.7%，29/55)明顯低于Orai1低表達組(76%，19/25)(Log-rank=4.633，P=0.031，圖3)。STIM1高表達組5年生存率(49%，24/49)明顯低于STIM1低表達組(77.4%，24/31)(Log-rank=7.833，P=0.005，圖4)。對Orai1表達(P=0.031)、STIM1表達(P=0.005)、患者年齡(P=0.89)、性別(P=0.751)、分化程度(P=0.184)、TNM分期(P=0.000)、淋巴結轉移(P=0.001)進行單因素生存分析顯示，Orai1表達、STIM1表達、TNM分期、淋巴結轉移與患者生存率均有相關性。Cox比例風險回歸模型多因素生存分析結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移是影響結腸腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，Orai1及STIM1表達不是影響患者預后的獨立危險因素(P>0.05，表4)。

圖3 Orai1表達與結腸腺癌患者生存率的關系

圖4 STIM1表達與結腸腺癌患者生存率的關系

預后因素BSEWalddfP值Exp(B)95.0%CI用于Exp(B)下限上限Orai1表達0.0430.5840.00510.9411.0440.3323.277STIM1表達0.0760.5740.01810.8951.0790.3503.323TNM分期2.6160.42238.4171<0.00113.6855.98331.301淋巴結轉移-1.7610.45115.2661<0.0010.1720.0710.416

3 討論

Orai1和STIM1是SOCE通道的核心蛋白，介導胞外Ca2+內流，STIM1是STIM的亞型之一，STIM蛋白位于細胞的內質網膜上，感受內質網內Ca2+濃度的變化。Orai1是Orai的亞型之一，Orai蛋白位于細胞膜，能夠被STIM所激活。STIM1位于人染色體11p15.5，蛋白相對分子質量為9.0×104，在人類正常組織中廣泛存在。Orai1為4次跨膜蛋白，位于人染色體12q24.31，蛋白相對分子質量為3.8×104[5]。Orai1和STIM1介導的SOCE通道在腫瘤中能夠促進腫瘤細胞血管的生成，影響細胞周期，促進腫瘤增殖、侵襲。研究顯示[6]，STIM1和Orai1介導的Ca2+通路在促進惡性黑色素瘤的侵襲過程中發揮重要作用，并提示Orai1主要通過對細胞外基質的降解促進黑色素瘤細胞侵襲。Umemura等[7]的研究結果進一步顯示，通過敲除STIM1或者Orai1能夠抑制黑色素瘤細胞的增殖，其機制是SOCE介導的細胞功能通過CaMKII Raf-1/ERK信號通路發揮作用。腫瘤細胞的侵襲轉移需要與細胞外基質黏附，黏附斑的拆裝依靠Pyk2,這些均需要Ca2+激活發揮作用，SOCE通道通過內質網釋放Ca2+，激活細胞膜上鈣通道，促進Ca2+內流，促進腫瘤侵襲[8]。

Orai1蛋白被證實在食管癌中過表達[9]，并且其表達與腫瘤分化及臨床分期相關，總生存期高表達者較低表達者短。Zhu等[10]研究結果顯示，在膠質瘤中，Orai1表達升高，下調Orai1能夠抑制SOCE通道從而抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲，其機制是調節Pyk2磷酸化。本組實驗結果顯示，Orai1在結腸腺癌中的表達高于正常結腸黏膜，兩者差異有統計學意義。并且Orai1在結腸腺癌中的表達與TNM分期及有無淋巴結轉移有關，與患者性別、年齡及分化程度無關。Orai1高表達組5年生存率低于低表達組。研究結果提示Orai1可能在結腸癌的發生、發展中起重要作用。

對STIM1的研究顯示，STIM1在非小細胞肺癌[11]、胃癌[2]中過表達。本組實驗結果顯示，STIM1在結腸腺癌中的表達顯著高于正常結腸黏膜，這與Wong等[12]研究結果顯示STIM1在結腸癌中高表達結果一致。本組實驗進一步顯示STIM1的高表達與結腸腺癌臨床分期及淋巴結轉移相關，并與患者預后相關，STIM1高表達組較低表達組預后更差。研究揭示STIM1與結腸癌的發生、發展及預后密切相關。

結腸癌的發生、發展是涉及多因素、多基因、多步驟的過程，許多基因被證明參與其中[13-14]。本組實驗發現，Orai1蛋白與STIM1蛋白在結腸癌中均過表達，并且Orai1與STIM1蛋白的表達呈正相關，兩者表達均與患者預后密切相關，提示Orai1與STIM1可能具有協同作用，共同促進結腸癌的發生、發展。Xia等[2]研究認為在胃癌中，Orai1和STIM1的高表達能夠上調MACC1的表達從而促進胃癌細胞增殖、侵襲及轉移。STIM1參與了肝癌的發生，其與HIF-1相互作用促進了肝癌的發展[15]。子宮頸癌中，STIM1過表達，對子宮頸癌細胞的增殖、遷移及血管生成起重要作用[8]。胰腺癌細胞中，STIM1和Orai1過表達免于凋亡從而促進腫瘤細胞增殖[16]。Orai1與STIM1蛋白在結腸癌中的作用機制有待于進一步深入探討。作為SOCE的關鍵分子，Orai1和STIM1可能是臨床治療結腸癌及預測預后的潛在新靶標。

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