小兒顛茄合劑微生物限度方法學驗證

倪兆武，戴宇婷，陳睿彥

（昭通市食品藥品檢驗所，云南 昭通 657000）

小兒顛茄合劑屬于解痙止痛醫院制劑，用于緩解胃腸痙攣引起的疼痛、惡心、嘔吐等，為各醫院常規制劑。微生物限度檢查作為控制藥品質量的一項重要指標，為了保證方法的適、，可靠，按照《中國藥典》2015年版的規定，對小兒顛茄合劑的微生物限度檢查方法適用性進行驗證。

1 儀器與試藥

1.1 樣品、培養基及試藥

小兒顛茄合劑（批號：160301、160314、160329），由某醫院提供。胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA（批號：1 5 1 2 2 3）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基S D A（批號：1512292）、麥康凱液體培養基（批號：160111）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：1512292）等培養基，以上均為北京三藥科技開發公司產品，并進行過培養基適用性檢查。其他試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

LRH-250F生化培養箱（上海一恒科技有限公司生產），EZ-StreamTMPump六聯過濾系統（密理博公司生產），BHC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司生產），YXQ-LS-75G壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司生產），Vitek2 Compact全自動微生物鑒定系統（法國梅里埃公司生產）。

1.3 試驗菌株

大腸埃希菌[CCMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，以上均由中國食品藥品檢定研究院提供，且菌株傳代次數均為2代。

2 實驗方法及結果

2.1 菌液的制備

分別將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、和黑曲霉培養物，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌或孢子數小于1000CFU的菌或孢子懸液，備用。

2.2 供試品的制備

取每個批號樣品兩份，將其混合均勻并作為供試液，取供試液作為原液，取原液，再用胰酪大豆胨液體培養基將供試液進一步稀釋成1：10、1：100的供試液。

2.3 微生物計數法

2.3.1 傾注法回收率測定

2.3.1.1 試驗組

取各稀釋級供試液各9.9 mL，每個稀釋級5份，每份中加入0.1 mL的試驗菌懸液后搖勻，吸取1mL注入無菌平皿中。加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的平皿傾注15～20 mL溫度不超過45℃TSA，35℃培養3天，計數；加白色念珠菌、黑曲霉的平皿分別傾注15～20 mL溫度不超過45℃TSA和SDA，傾注TSA的平皿于35℃培養5天，傾注SDA的平皿于25℃培養5天，逐日觀察，計數。每種試驗菌每種培養基至少制備2個平皿，以算數平均值作為計數結果。

2.3.1.2 供試品對照組

取制備好的供試液1mL至平皿中，每個稀釋級平行4皿，其中2個傾注TSA，另2個傾注SDA，同法培養，計數。

2.3.1.3 菌液對照組

取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液（胰酪大豆胨液體培養基）替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液，同法培養，計數。

2.3.1.4 空白實驗

以稀釋液檢查，同法培養，計數。

2.3.2 實驗結果

采用常規法檢查，在TSA中：原液供試品對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌人工染菌回收率均小于 50%，其余3種菌回收率在 0.5～2 范圍內；1：10稀釋級對5種菌的人工染菌回收率均在 0.5～2 范圍內。在沙氏 葡萄糖瓊脂培養基中：原液供試品對2種菌的人工染菌回收率均在0.5～2范圍內。因此，本品原液需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數的計數未達到要求，需要消除其抑菌活性或重新選擇適當的方法再進行驗證。但1：10稀釋級的需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數的計數結果符合要求。見表1。

表1 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數驗證結果（CFU/mL）

2.3.3 薄膜過濾法

2.3.3.1 加入30 mL無菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤濕濾膜，取2.3.1.1、2.3.1.2、2.3.1.3的供試液及緩沖液1 mL過濾，用100 mL緩沖液沖洗，反復沖洗3次，并按2.3.1.1要求進行培養；逐天觀察結果并記錄。

2.3.4 實驗結果

按傾注法回收率測定所述的計算公式，代入實驗結果計算。本品采用薄膜過濾法進行測定，5種菌原液時的回收率均在0.5～2范圍內。見表2。

2.4 大腸埃希菌檢查方法

2.4.1 試驗組

取原液及不大于100CFU的大腸埃希菌菌懸液各1 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，35℃培養18～24 h。取上述培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基中，42℃培養24～48 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上35℃培養18～72 h。

2.4.2 陽性對照試驗

接種不大于100CFU的大腸埃希菌至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，照試驗組培養操作。

2.4.3 陰性對照試驗

以稀釋液代替供試液照試驗組培養操作，見表3。

表2 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數驗證結果（CFU/mL）

表3 大腸埃希菌結果

3 討 論

根據《中國藥典》2015版的相關規定，為了確認所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查，必須對相應檢驗方法進行方法學驗證。因無法判定小兒顛茄合劑的成分，工藝對需氧菌、霉菌和酵母菌以及控制菌大腸埃希菌的抑菌程度，因此對不同稀釋級的常規法進行考察。通過實驗表明，原液時對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌抑菌明顯，回收率達不到要求，以1：10的稀釋級為最低稀釋級可以開展檢驗，其次薄膜過濾法能很好消除抑菌影響，可以以原液為最低稀釋級。

[1] 中國藥典:四部[S].2015年:附錄136-151。

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].中國醫藥科技出版社.2010:351-382

[3] 嚴曉明,劉 萌,等.四種醫院制劑微生物限度檢查方法學驗證[J].中國藥事2015,29(5):485-491

[4] 曹 云,郭曉娟.藥品微生物限度檢查方法學驗證及其相關的技術問題[J].天津藥學,2006,18(06):259-260.