自制改性碳納米管分散固相萃取吸附劑—高效液相色譜法同時檢測大米中4種黃曲霉毒素

袁 芹

(連云港職業技術學院，江蘇 連云港 222006)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是一類由黃曲霉、寄生曲霉菌等多種霉菌產生,是一組化學結構類似的二呋喃香豆素的衍生化合物,具有很強毒性，能嚴重破壞人和動物的肝臟組織，嚴重時會導致肝癌甚至死亡。世界上大多數國家和地區都規定其在食品中限量要求，并要求對黃曲霉毒素進行有效監管[1]。目前已經發現的黃曲霉毒素及其衍生物有20余種，天然產生的黃曲霉毒素根據其化學結構不同分為B1、B2、G1、G2四種(結構式見圖1)。其中以AFB1的毒性最大。

食品中黃曲霉毒素的檢測方法常見的有超臨界流體萃取技術、加壓流體萃取技術、固相萃取技術、免疫親和層析技術等[2]。分散固相萃取法(dSPE)是近十年發展起來的新型樣品前處理方法, 將凈化吸附材料直接分散于待凈化的提取液中, 吸附基質中的干擾成分,集萃取和凈化于一身,具有操作簡便高效、溶劑用量少、無需特殊設備等優點, 是一種綠色環保的樣品前處理方法[3]。

碳納米管(CNTs)與傳統材料相比，具有比表面積大、化學性質穩定、吸附性能強等特點，近年來已被用于吸附材料[4-5]。但CNTs的水不溶性等理化性質又限制其應用。通過對CNTs修飾、改性以提高其性能。改性后CNTs管，由于其微結構發生變化，使CNTs管具有更優異的吸附特性[6]。我們前期的研究表明，碳納米管經海藻酸鈉改性后具有良好的分散性能和吸附性能[7,8]。目前對于利用改性碳納米管作為dSPE凈化吸附材料, 結合HPLC同時檢測大米中4種黃曲霉毒素的相關報道較少。

本文采用自制的改性碳納米管作為dSPE凈化吸附材料，結合HPLC同時測定大米中的4種黃曲霉毒素，有效地消除了基質效應，建立的方法靈敏度高，為納米技術在食品檢測中的應用提供了依據。

圖1 黃曲霉毒素的結構式Fig 1 Structures of AFT

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20 AT HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器(日本島津公司)；BL6-180型高功率數控超聲波清洗器(上海比朗儀器有限公司)；MS3 minishaker旋禍混勻器(IKA公司,德國)。

SAL-MWCNT-COOH(連云港職業技術學院自制)；AFB1、B2、G1、G2標準品(Sigma 公司,美國);甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；實驗用水為去離子蒸餾水，其他試劑均為分析純。

大米樣品:購于江蘇省連云港市市場。

1.2 標準溶液配制

分別稱取適量AFB1、B2、G1、G2標準品，用乙腈配制成100 mg/L的單標儲備液，吸取適量單標儲備液用乙腈稀釋成不同濃度的混合標準系列工作液。以內標法定量。

1.3 樣品前處理

稱取適量大米樣品磨碎，備用。稱取5 g磨碎的大米樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入100 μg/L內標工作液100 μL，然后加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)，渦旋混勻1 min，置超聲波清洗器中超聲提取10 min，再以5 000 r/min離心5 min，收集上清液至另一50 mL聚丙烯塑料離心管中。用純凈水稀釋上清液至40 mL，混勻后取其中20 mL，加入適量SAL-MWCNTS-COOH，中速振蕩提取2 min，以10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，殘余物中加入適量的乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，以10 000 r/min離心2 min，上清液于40 ℃下氮氣吹干，用乙腈-水(50∶50， v/v)溶解殘余物，渦旋1 min后以8 000 r/min離心3 min，吸取上清液過0.22μm濾膜后供HPLC分析。

1.4 HPLC條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈和水；柱溫：35 ℃，進樣體積20 μL；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫程序：0～7 min。

乙腈60%(體積分數，下同)，7～30 min乙腈60%線性升至90%；檢測波長365 nm。

2 結果與討論

2.1 dSPE條件的優化

2.1.1提取液濃度的優化

目前，黃曲霉毒素的提取方法主要以甲醇—水、乙腈—水為提取劑液。本文在參考文獻[9～12]的基礎上，選擇乙腈—水作為提取液，比較了60、75、80、85、90%乙腈—水的提取效率，經過比較發現采用80%乙腈—水溶液對4種黃曲霉毒素提取效果總體最佳，均迗到93.5%以上的回收率，故選擇80%乙腈—水溶液作為提取溶液。

2.1.2提取液pH值的影響

添加混合標準中間液(10 000 μg/L) 400 μL于20 mL空白大米樣品提取液中，加水稀釋至40 mL， SAL-MWCNT-COOH用量為200 mg，調節pH 值為3-10，T=25 ℃ ，按1.3所述進行操作，來考察提取液pH值對回收率的影響，結果見圖2。

由圖2可知， 4種黃曲霉毒素的吸附率在提取液pH值為7時回收率最大。這是由于黃曲霉毒素在中性溶液中較穩定，但在強酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的強堿溶液中，其內酯環開裂分解迅速，導致待測物與SAL-MWCNT-COOH吸附效率大大下降。因此，本實驗選擇提取液的pH值為7進行dSPE研究。

圖2 提取液pH對回收率的影響Fig 2 Effect of pH on recovery

2.1.3SAL-MWCNT-COOH用量的影響

在提取液pH值為7，T=25 ℃ 條件下，SAL-MWCNT-COOH復合物對大米中黃曲霉毒素的回收率隨其投加量的變化見圖3。

圖3 SAL-MWCNT-COOH用量對回收率的影響Fig 3 Effect of SAL-MWCNT-COOH on recovery

由圖3可知，當SAL-MWCNT-COOH復合物的投加量在25～200 mg范圍內時，吸附率隨其投加量增大而急劇增加，這是由于吸附劑的量增多，增加了有效官能團和吸附的活性位點，當SAL-MWCNT-COOH復合物投加量為125 mg時，四種黃曲霉毒素的平均回收率達到92.5%，繼續增大投加量，回收率變化不大。所以從經濟角度考慮，并不是吸附劑量越大越好。

2.1.4洗脫液的選擇

考慮到黃曲霉毒素的脂溶性，在上述優化后的最佳條件下進行洗脫劑選擇試驗，考察了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等溶劑，結果發現以乙酸乙酯作洗脫劑時大米中四種黃曲霉毒素的回收率較高(圖4)，故選擇用乙酸乙酯作洗脫劑。

對乙酸乙酯進行體積優化，洗脫溶劑體積對回收率的影響見表1。從表1可看出，隨著洗脫體積增多，四種黃曲霉毒素的洗脫回收率增大，當洗脫液體積為25 mL時，四種黃曲霉毒素未能被完全洗脫；當洗脫體積大于25 mL時，四種黃曲霉毒素的洗脫回收率變化不大，故本實驗宜選擇25 mL乙酸乙酯作為洗脫劑。

圖4 不同洗脫液對回收率的影響Fig 4 Effect ofdifferent eluent on recovery

AF名稱回收率/(%)5mL10mL15mL20mL25mL30mL35mLAFB175．3584．1386．7494．1496．5097．4598．13AFB270．1375．4482．4589．1792．0292．2393．57AFG169．2675．4780．3288．3691．6392．6692．66AFG257．9166．5972．3481．0590．1591．0191．23

2.2 色譜條件的優化

2.2.1檢測波長

用紫外檢測器對分離后的4種黃曲霉毒素標準溶液在200～400 nm 波長范圍內進行掃描，根據儀器對不同黃曲霉毒素的響應信號強弱，實際大米樣品中黃曲霉毒素殘留的含量以及基線平穩狀況，確定了檢測波長為365 nm。

2.2.2流動相及流速

考察了甲醇一水和乙腈一水作為流動相的相對情況。結果表明，當以甲醇--水為流動相時，基線漂移嚴重，色譜出現拖尾現象；以乙腈—水為流動相時，基線穩定且4種黃曲霉毒素分離度能達到分析要求。在乙腈--水作為流動相的基礎上考察了流速為0.4、0.6、0.8、1．0 mL/min時對4種黃曲霉毒素分離度的影響。當流速為0.6mL/min時，效果最好，故流速選擇為0.6 mL/min。

2.3 方法的線性和檢出限

將現有的4種黃曲霉毒素標準品配制成質量濃度為0.2、0.4、 1.0、 5.0、10.0、 20.0、 40.0、100.0、200.0μg/L9個水平的混合標準溶液，在優化條件進行測定，以標液的質量濃度(X，mg/L)與峰面積(y)作標準曲線，得到曲線的回歸方程如表2所示，在0.2～200.0 μg/L線性范圍內，線性關系良好。以1.0μg/L的混合標準溶液樣品，按3倍信噪比計算，4種黃曲霉毒素的檢出限為0.043、0.031、0.028、0.018μg/L；以10倍信噪比計算，其定量下限為0.142、0.103、0.090 2、0/073 μg/L。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數及方法的檢出限Table 2 Linear ranges ,linear equation ,correlation coefficient(r) and limits of the method

2.4 方法的精密度和準確度

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法,對大米樣品中4種黃曲霉毒素進行添加回收率試驗,加標濃度為0.2～200.0 μg/kg，每個濃度平行進行6個水平分析，結果顯示，4種黃曲霉毒素的加標回收率分別為84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)位5.8～9.2%(見表3)。

2.5 實際樣品檢測

采用該方法對市售的新大米檢測，均未查出4種黃曲霉毒素。

表3 添加回收率Table 3 The recoveries and precisions of aflatoxin Bl，B2，G1and G2 in spiked samples(n=6)

3結 論

本文采用自制的改性碳納米管作為dSPE填料用于大米中黃曲霉毒素的dSPE- HPLC檢測，優化實驗條件下，在 0.2～200.0μg /L線性范圍內，所得4種黃曲霉毒素的回歸方程均具有良好的線性關系，相關系數為0.9987～0.9998, 檢出限為0.043、0.031、0.028、0.018 μg/L，定量下限為0.142、0.103、0.0902、0/073 μg/L；加標回收率分別為84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)為5.8～9.2%，可滿足痕量分析的要求。

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