基于指標(biāo)成分與近紅外光譜對(duì)寧夏野生和栽培甘草的比較鑒別研究

狄天云+高曉娟+張霞+趙建軍+雍婧姣+馬玲+王英華+王漢卿

[摘要]比較寧夏烏拉爾甘草（以下均簡(jiǎn)稱甘草）中基于指標(biāo)成分含量的色譜鑒別和基于近紅外光譜的光譜鑒別差異，建立快速有效鑒別寧夏野生和栽培甘草的方法。采用HPLC和紫外光譜法測(cè)定9批野生甘草和14批栽培甘草中甘草苷、甘草酸和總黃酮的含量并采集其近紅外光譜信息。結(jié)果顯示，基于指標(biāo)成分定量的色譜鑒別無(wú)法有效鑒別寧夏野生和栽培甘草，近紅外光譜結(jié)合聚類(lèi)分析和主成分分析能夠直觀、快速、有效鑒別寧夏野生和栽培甘草樣品，為甘草生長(zhǎng)方式的鑒別及應(yīng)用研究提供有效方法。同時(shí)，為甘草的品種、產(chǎn)地及規(guī)格等方面的鑒別提供了研究思路。

[關(guān)鍵詞]甘草； 近紅外； 指標(biāo)成分； 聚類(lèi)分析； 主成分分析； 鑒別

[Abstract]This study is to construct a rapid and effective method for identification of wild and cultivated Glycyrrhiza uralensis （hereinafter referred to as Glycyrrhizae Radix et Rhizoma） from Ningxia by comparison of the difference in chromatography identification based on index components and near-infrared spectroscopy identification. HPLC and UV methods were used to determine the content of liquiritin， glycyrrhizate and total flavonoids for 9 wild Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and 14 cultivated Glycyrrhizae Radix et Rhizoma samples，and the near-infrared spectroscopy was also，collected. The results illustrated that the chromatography identification based on index components could not identify wild and cultivated Glycyrrhizae Radix et Rhizoma from Ningxia， while near-infrared spectroscopy could quickly and effectively achieve it. It provides an effective method for the growth pattern identification and application of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma.

[Key words]Glycyrrhiza uralensis （Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）； near-infrared spectroscopy； index components； cluster analysis； principal components analysis； identification

甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma為豆科植物甘草（又稱烏拉爾甘草）Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草G.inflata Batal.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根莖^[1]，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功，素有“十方九草”之稱。在我國(guó)，甘草分布范圍最廣，主要分布在西北、東北和華北地區(qū)，以中西部地區(qū)（內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅）所產(chǎn)的西甘草而聞名^[2]。甘草作為藥材、食品及煙草添加品，其市場(chǎng)需求量急劇增加，野生資源過(guò)度采挖^[3]，蘊(yùn)藏量不足50萬(wàn)t^[2]，被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》二級(jí)保護(hù)野生藥材，2000年國(guó)務(wù)院發(fā)布的《關(guān)于禁止采集和銷(xiāo)售發(fā)菜。制止濫挖甘草和麻黃草有關(guān)問(wèn)題的通知》明令禁止對(duì)甘草的掠奪性采挖。目前，市售甘草以人工栽培為主。但是由于栽培與野生藥材之間存在質(zhì)量差異^[2，4]，對(duì)二者進(jìn)行鑒定區(qū)分，有利于合理使用以提高臨床療效。

中藥鑒定旨在研究中藥的品種、質(zhì)量，保證臨床療效。目前，對(duì)于中藥鑒定研究除傳統(tǒng)的基源鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別外，以指紋圖譜研究較多^[5]，其次，分子鑒定也已逐步開(kāi)展^[6]。指紋圖譜雖然可以反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，但是需要考慮產(chǎn)地、采收期等因素對(duì)化學(xué)成分的影響，且需要對(duì)藥材進(jìn)行前處理；分子鑒定專屬性強(qiáng)，但是其操作復(fù)雜，且成本高^[7]。近紅外光譜作為一種快速、價(jià)廉、無(wú)損分析方法，其與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合，已被用于農(nóng)業(yè)、食品、化學(xué)和石油化工等領(lǐng)域的定性和定量分析^[8-9]，已被歐美藥典納入附錄內(nèi)容^[10-11]。近紅外光譜分析技術(shù)在中藥材真?zhèn)巍絺巍a(chǎn)地、同屬中藥品種和中成藥的鑒定及含量測(cè)定等方面已有相關(guān)研究報(bào)道，但是關(guān)于其對(duì)不同生長(zhǎng)方式（野生和栽培）的鑒定研究報(bào)道鮮少。

本研究采用近紅外光譜技術(shù)建立寧夏14批栽培甘草和9批野生甘草的近紅外光譜，并對(duì)光譜采用不同的預(yù)處理方法預(yù)處理后進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析。同時(shí)，采用HPLC及紫外光譜法對(duì)各批甘草中指標(biāo)成分甘草苷、甘草酸和總黃酮進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其含量進(jìn)行聚類(lèi)分析。對(duì)近紅外分析結(jié)果和指標(biāo)成分含量分析結(jié)果進(jìn)行比較研究，進(jìn)而確定寧夏野生和栽培甘草的鑒定方法。

1 材料

1.1 儀器

Bruker Matrix-F型傅利葉變換近紅外光譜儀（測(cè)試條件：分辨率8 cm^-1；樣品累積掃描次數(shù)32 Scans；背景累積掃描次數(shù)

32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm^-1；軟件為OPUS 5.5）；高效液相色譜儀（Agilent 1260 LC色譜工作站，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1311A四元泵，G1379A脫氣機(jī)，GB15B二極管陣列檢測(cè)器）；島津UV1901紫外分光光度計(jì)；梅特勒XS-205電子分析天平。

1.2 試劑

甘草苷、甘草酸對(duì)照品（批號(hào)111610-201106，110731-201418）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-200707）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

實(shí)驗(yàn)所用的23批甘草藥材采自寧夏不同產(chǎn)區(qū)，栽培甘草生長(zhǎng)年限3年，經(jīng)王英華主任藥師鑒定為豆科植物甘草G. uralensis，樣本信息見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 近紅外光譜測(cè)定

分別取甘草藥材粉末適量，在Bruker Matrix-F型傅利葉變換近紅外光譜儀掃描近紅外光譜，測(cè)試條件：分辨率8 cm^-1；樣品累積掃描次數(shù)32Scans；背景累積掃描次數(shù)32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm^-1；軟件為OPUS 5.5。每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，取平均值作為該樣品的原始光譜，環(huán)境條件為：溫度23 ℃，濕度40%。

2.2 甘草指標(biāo)成分檢測(cè)

2.2.1 甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2015年版一部甘草【含量測(cè)定】項(xiàng)下甘草苷、甘草酸的測(cè)定方法測(cè)定。

2.2.2 總黃酮的含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)測(cè)定總黃酮含量^[12]。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 近紅外光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理 采用OPUS5.5軟件對(duì)各批次甘草近紅外光譜分別進(jìn)行矢量歸一化、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化和二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理，導(dǎo)出各近紅外光譜點(diǎn)數(shù)據(jù)。

2.3.3 聚類(lèi)分析 采用R語(yǔ)言3.2.3對(duì)甘草近紅外光譜預(yù)處理后的數(shù)據(jù)及指標(biāo)成分含量數(shù)據(jù)分別進(jìn)行進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2.3.4 主成分分析 采用SIMCA13.0對(duì)甘草近紅外光譜預(yù)處理后的數(shù)據(jù)及指標(biāo)成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 近紅外分析結(jié)果

3.1.1 近紅外光譜圖預(yù)處理 近紅外光譜常受到光程、樣品厚度、基線漂移等因素的影響，在分析之前需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。矢量歸一化可以消除光程或樣品厚度的影響，而導(dǎo)數(shù)化可以消除基線漂移等因素的影響。本研究將測(cè)得的近紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入OPUS5.5軟件中獲得23批甘草樣本的近紅外光譜圖見(jiàn)圖1。所有測(cè)得的近紅外光譜分別采用矢量歸一化、一階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化、二階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理后，經(jīng)離差平方和法聚類(lèi)和主成分分析，能夠區(qū)分野生和栽培甘草的聚類(lèi)正確率及第一主成分貢獻(xiàn)率見(jiàn)表2。由表2可知，采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理方式對(duì)23批甘草近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理后，離差平方和聚類(lèi)分析可以完全將野生和栽培甘草進(jìn)行分類(lèi)，第一主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)到99.1%，故采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化方法對(duì)所得近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后光譜圖見(jiàn)圖2。

3.1.2 近紅外光譜聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析通過(guò)計(jì)算樣品間的統(tǒng)計(jì)量（距離或相關(guān)系數(shù)等），逐步將相關(guān)性最大的樣品聚在一起，直到所有樣品歸為一類(lèi)^[13]。本研究將一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理后的近紅外數(shù)據(jù)基于歐式距離采用7種聚類(lèi)方法（最長(zhǎng)聚類(lèi)法、最短距離法、中間距離法、類(lèi)平均法、重心法、離差平方和法和Mcquitty相似法）進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果顯示，只有離差平方和法聚類(lèi)結(jié)果可以完全將野生和栽培甘草進(jìn)行分類(lèi)，見(jiàn)圖3，最長(zhǎng)距離法和Mcquitty相似法的聚類(lèi)正確率為91.3%，類(lèi)平均法的聚類(lèi)正確率69.6%，最短距離法、重心法和中間距離法聚類(lèi)正確率僅為65.2%。這與各聚類(lèi)方法計(jì)算距離的公式相關(guān)。聚類(lèi)的目的是使類(lèi)內(nèi)差異較小，而類(lèi)間差異較大；聚類(lèi)結(jié)果中各類(lèi)包含元素即不太多，也不太少^[14]。本研究采用不同的聚類(lèi)方法聚類(lèi)后顯示，離差平方和聚類(lèi)法在分析野生和栽培甘草近紅外光譜時(shí)能夠達(dá)到聚類(lèi)的目的，效果最好，可以100%將野生和栽培甘草進(jìn)行分類(lèi)，表明甘草近紅外光譜經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法后采用適當(dāng)?shù)木垲?lèi)分析方法可以有效區(qū)分野生和栽培甘草。

3.1.3 近紅外光譜主成分分析 將甘草近紅外光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA13.0軟件進(jìn)行主成分分析。第一主成分代表了總變異的99.1%，為甘草近紅外光譜最重要的信息，第一主成分和第二主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.6%，僅有0.4%的信息丟失，能夠反映近紅外光譜的大量信息。近紅外光譜主成分的載荷圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，野生甘草聚為一簇，栽培甘草聚為一簇，說(shuō)明野生和栽培甘草樣品具有差異，表明甘草近紅外光譜經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后經(jīng)主成分分析能夠有效區(qū)分野生和栽培甘草，與聚類(lèi)結(jié)果一致。

3.2 各指標(biāo)成分含量分析

3.2.1 各指標(biāo)成分含量測(cè)定 23批甘草樣品中甘草苷、甘草酸和總黃酮的含量測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由表1可得，各批次甘草中甘草苷和甘草酸的含量均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，為合格藥材；總黃酮含量均高于3.0%。

3.2.2 3種指標(biāo)成分聚類(lèi)分析 3種指標(biāo)成分基于歐式距離采用7種聚類(lèi)方法進(jìn)行聚類(lèi)，共得到兩種聚類(lèi)結(jié)果，均不能將野生和栽培甘草進(jìn)行分類(lèi)。離差平法和聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.2.3 3種指標(biāo)成分主成分分析 23批甘草樣本中3種指標(biāo)成分的含量主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，第一主成分涵蓋了總變異的93.7%，將所有甘草樣本分為2類(lèi)，N22C為一類(lèi)，其余樣本為另外一類(lèi)，同樣不能將野生和栽培甘草分類(lèi)，與聚類(lèi)結(jié)果一致。

4 討論

近紅外光譜結(jié)合聚類(lèi)分析和主成分分析對(duì)23批甘草藥材進(jìn)行鑒別分析，運(yùn)用OPUS5.5軟件對(duì)光譜進(jìn)行6種不同預(yù)處理后，采用R語(yǔ)言3.2.3和SIMCA13.0分別進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析，根據(jù)野生和栽培聚類(lèi)正確率和第一主成分貢獻(xiàn)率篩選甘草近紅外光譜最佳預(yù)處理方式，結(jié)果顯示甘草近紅外光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理后野生和栽培聚類(lèi)正確率為100%，第一主成分貢獻(xiàn)率高達(dá)99.1%，能夠反映樣品的主要信息。近紅外光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理后基于歐式距離的離差平方和聚類(lèi)結(jié)果顯示野生和栽培甘草分別聚為兩類(lèi)，可以通過(guò)聚類(lèi)分析將二者進(jìn)行區(qū)分。主成分分析的載荷圖表明甘草近紅外光譜通過(guò)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后經(jīng)主成分分析能夠有效區(qū)分野生和栽培甘草。

采用HPLC對(duì)23批甘草藥材中甘草苷和甘草酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示23批甘草藥材均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，為合格藥材。基于3種指標(biāo)成分（甘草苷、甘草酸和總黃酮）的含量數(shù)據(jù)，采用歐氏距離的7種聚類(lèi)方法（最長(zhǎng)距離法、最短距離法、中間距離法、類(lèi)平均法、重心法、離差平方和法、Mcquitty相似法）進(jìn)行2聚類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果說(shuō)明該3種指標(biāo)成分不能有效區(qū)分野生與栽培甘草。主成分分析結(jié)果與聚類(lèi)結(jié)果相一致。

通過(guò)近紅外光譜可以獲得生物樣品中所有有機(jī)分子含氫基團(tuán)和C=O、C=C基團(tuán)的特征信息，因此土壤、氣候、水分等綜合因素作用下對(duì)野生甘草和栽培甘草的多類(lèi)成分（如纖維、蛋白、糖類(lèi)等）產(chǎn)生的影響而形成差異，體現(xiàn)在近紅外光譜的差異，從而實(shí)現(xiàn)鑒別。已有研究表明，利用紅外或近紅外光譜可以快速鑒別野生和栽培燈盞花、肉蓯蓉、丹參、天麻、栽培和半野生黃芪^[15-19]。而甘草酸、甘草苷及總黃酮的含量也受多種因素影響，但特征類(lèi)型簡(jiǎn)單，在野生和栽培甘草中的變化是連續(xù)的，因此不能對(duì)二者進(jìn)行有效鑒別。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]