CaO/ZnO核-殼結構納米材料抗菌性能的初步研究

王麗麗 孫源卿 張穎麗 孫宏晨 林權 于維先 李祥偉

口腔是一個有菌環境，細菌必然影響口腔疾病的治療效果及預后。口腔臨床常用的氧化鋅和氫氧化鈣類材料抑菌性能較差[1],氫氧化鈣材料穩定性較差，易被吸收或溶解[2]，另外，殘余材料還會影響氧化鋅與丁香油的螯合反應[3]而影響材料性能。因此，本研究檢測CaO/ZnO核-殼結構納米材料的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

氧化鋅粉、丁香油酚、(上海阿拉丁生物試劑有限公司)；iRoot根管封閉劑(貝曼科學醫藥有限公司，瑞士，批號：14002SP)、鹽酸米諾環素軟膏(Sunstar INC，日本，批號：1509041)；臺式高速離心機(5810，Eppendorf，德國)；掃描電子顯微鏡(JEM- 6700F, JEOL,日本)；透射電子顯微鏡(H- 800，HITACHI，日本)；等離子體發射光譜儀(Optima 3300DV, PerkinElmer，美國)；酸度計(PB- 10，賽多利斯科學儀器有限公司，中國)；變形鏈球菌(標準菌株ATCC- 25135)、糞腸球菌(標準菌株ATCC- 29212)、大腸桿菌(標準菌株ATCC- 11229)、金黃色葡萄球菌(標準菌株ATCC- 25923)。

1.2 CaO/ZnO核-殼結構納米球制備及表征檢測

采用液相沉淀法制備CaO/ZnO核-殼結構納米球，掃描電鏡(SEM)觀察表面形貌，透射電鏡(TEM)觀察球粒大小、電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)分析其離子組成。

1.3 CaO/ZnO核-殼結構納米球的離子釋放

1.3.1 pH值檢測 將制備的CaO/ZnO核-殼結構納米材料分散于PBS(pH 7.2)中，恒溫持續震蕩(90 r/min)，分別在3、6、12、24、48 h時間點，將反應體系離心，取上清液5 ml，在室溫條件下，測定pH，反應體系再補充等體積的新鮮PBS。

1.3.2 CaO/ZnO核-殼結構納米材料的鈣離子累積釋放量測定 用上述收集的上清液作為待測樣品，應用甲基麝香草酚藍法(MTB)[4]，用紫外分光光度計測定待測試樣、對照試樣及標準樣。再檢測試樣的鈣濃度。鈣濃度(mmol/L)=樣品管吸光度/標準管吸光度×2.5

1.4 抑菌性檢測

參照Morgental等[5]瓊脂擴散實驗，在無菌操作條件下，分別將金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和變形鏈球菌復蘇，稀釋至密度為3.0×108CFU/ml，分別將上述各細菌懸液100 μl滴于MH瓊脂培養基表面，用無菌棉拭子將菌液均勻涂布至整個培養基表面。

在涂布好細菌的培養基內打孔，每個培養基內打5 個孔(孔徑為5.0 mm，深為5.0 mm)，將每個孔分別放置新鮮配制的氧化鋅-丁香油材料(1∶1粉/液比)、CaO/ZnO-丁香油材料(1∶1粉/液比)、iRoot SP材料，鹽酸米諾環素軟膏(派力奧)(陽性對照)，PBS緩沖液(陰性對照)。室溫下放置2 h，再將所有培養皿在37 ℃恒溫箱內培養48 h后，用游標卡尺測得抑菌環直徑(是指打孔處圓心至細菌生長的最內緣之間的距離)，所有實驗均做3 份。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 CaO/ZnO核-殼結構納米球的表征

CaO/ZnO核-殼結構納米球的外觀為白色粉末(圖 1A)。SEM下材料顆粒為球形且分散均勻(圖 1B)，TEM下可見該納米球具有核-殼結構(圖 1C)，粒徑范圍為80～90 nm(圖 1D)。

經ICP檢測可見CaO/ZnO核-殼結構納米球材料含有2 種金屬元素Ca和Zn(表 1)，這說明，制備的CaO/ZnO核-殼結構納米球材料由ZnO和CaO組成。

A： 外觀； B： SEM觀察； C： TEM觀察； D： 粒徑分布

表 1 CaO/ZnO核-殼結構納米球的ICP檢測結果

2.2 CaO/ZnO核-殼結構納米球材料的離子釋放性

CaO/ZnO核-殼結構納米球分散在PBS后，在不同時間點，鈣離子釋放和溶液pH值的變化情況見圖 2。

A：Ca2+濃度變化； B： pH值變化

2.3 CaO/ZnO核-殼結構納米球材料的抑菌性

圖 3為CaO/ZnO核-殼結構納米球抑菌性檢測結果。3 種材料均能抑制細菌的生長，陰性對照組無抑菌性。CaO/ZnO核-殼結構納米球-丁香油材料對大腸桿菌、變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌所形成的抑菌環直徑均較大，分別為(21.38±0.66)、(26.86±0.51)、(18.45±0.77) mm，均優于氧化鋅-丁香油組及iRoot SP組(P﹤0.01)；各材料對糞腸球菌形成的抑菌環均較小，但CaO/ZnO-丁香油組對其形成的抑菌環(9.99±0.40) mm仍大于其他材料所形成的抑菌環(P﹤0.01)。CaO/ZnO-丁香油組與陽性對照組間的抑菌環大小無統計學差異(P﹥0.05)。

3 討 論

牙體牙髓病及牙周病為口腔常見疾病，經研究證實其主要致病因素為細菌感染[6]。ZnO和Ca(OH)2是治療該類疾病的較常用材料[7]，但是其抑菌效果較有限[1]。增強ZnO和Ca(OH)2類材料抑菌性的課題成為目前研究的熱點之一。為此，本研究設計和制備了CaO/ZnO核-殼結構納米球來提高其抑菌性能，經表征觀察和相關檢測，證實該材料具有優良的抑菌性和適宜的理化性質。

圖 3 材料的抑菌性檢測結果

本研究制備的CaO/ZnO核-殼結構納米球的粒徑范圍為80～90 nm(圖 1)，而根管內不同水平的牙本質小管開口直徑為2.65～3.23 μm[8]，說明，本研究所制備的納米球在顆粒尺度方面易于填入牙本質小管。

本實驗選擇了臨床上較常應用的根管封閉劑(iRoot糊劑)和窩洞暫封材料(氧化鋅-丁香油)作為對照。通過對比可見，CaO/ZnO核-殼結構納米球材料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變形鏈球菌的抑菌性均大于iRoot及氧化鋅-丁香油(P<0.01)。CaO/ZnO核-殼結構納米球材料對糞腸球菌的抑制性較弱，但是，其抑菌效果較iRoot組和氧化鋅組均較強(P<0.01)；這可能與糞腸球菌經常以生物膜的形式存在，而生物膜內的細菌對抗生素的耐藥性較高有關，還可能與該菌在堿性條件下仍可繼續存活的特性有關[9]，而這些特性也是許多感染細菌難以被根除的重要原因之一[10]。由此可見，CaO/ZnO核-殼結構納米球材料具有很好的抗菌性。

研究制備的CaO/ZnO核-殼結構納米球在PBS中可持續釋放Ca2+和OH-，溶液pH值隨時間的增加而升高(圖 2)，pH值增高具有抑菌作用[11]，逐步釋放的Ca2+及升高的pH值可促進局部組織礦化[12]，這在治療口腔病變，特別是牙體和牙周組織疾病方面具有積極效應[13]。該材料通過升高局部pH值，改變細菌正常生長所需的酸性環境，破壞細菌蛋白質及DNA，從而產生抑菌和殺菌作用[6]；中和細菌產生的毒性代謝產物[14]，這可能是本研究所制備的CaO/ZnO核-殼結構納米球材料具有優異抑菌性的內在機制。如將該新型材料用作根管封閉劑或其輔料，Ca2+可以與牙本質中的羥磷灰石發生反應，形成磷酸鈣以封閉牙本質小管[15]；還可以激活堿性磷酸酶活性，促進根尖周組織修復和重建[12]。如將該材料用作窩洞暫封材料，Ca2+可促進脫礦牙本質的再礦化[5]。

本研究結果證實所制備的CaO/ZnO核-殼結構納米球材料具有很好的抑菌性，可望成為治療牙體等口腔硬組織疾病的抑菌性材料或其輔料。