低氧條件對小鼠ADSCs膜片形成及其生物學特性的影響

周宇超 高曉彤 劉向偉 譚乃文 魏洪波 宋應亮

目前，不受倫理學制約的間充質干細胞是再生醫學領域的熱門種子細胞，而脂肪間充質干細胞(ADSCs)是其典型代表[1]。為了更好地控制干細胞的增殖分化進而解決臨床問題，越來越多的研究集中于影響干細胞生存與功能的 “干細胞龕”[2-3]，例如細胞膜片技術就因在高度密集細胞的同時保存了豐富的細胞外基質(ECM)，從而為干細胞提供適宜微環境而受到人們青睞[4-5]，廣泛應用于包括口腔領域在內的多種組織器官再生[6-8]。而氧含量是干細胞龕的重要組成部分。不同于傳統細胞培養時的常氧環境，體內各組織氧分壓往往較低[9]；脂肪組織中<3%[10]。因此，有學者提出低氧環境可能更貼近ADSCs的生理環境而更利于其生存。事實上，已有研究表明體外低氧培養會影響ADSCs的增殖、分化和功能[11-13]；但其對ADSCs細胞膜片的影響尚未見報道。

本研究利用不同濃度的氯化鈷(CoCl2)模擬體內低氧環境，觀察其對ADSCs膜片構建和生物學特性的影響，以期找到ADSCs膜片體外培養的最適條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

OriCellTMC57BL/6小鼠ADSCs完全培養基(賽業)；Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國)；抗壞血酸(科昊)；六水合氯化鈷CoCl2、β- actin一抗(Sigma，美國)； RIPA(Beyotime)；HIF- 1α一抗(三鷹)，抗兔、鼠二抗(博士德)；Trizol(Invitrogen)；反轉錄、qPCR試劑盒(Takara)；引物合成(尼桑)。CO2培養箱(Heraeus，德國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；qPCR儀(AB 7500，美國)；垂直電泳槽、電泳儀、轉膜儀(Bio- Rad，美國)；細胞培養皿和培養板(Thermo,美國)。C57BL/6小鼠(8 周，SPF級)，購于第四軍醫大學實驗動物中心。

1.2 ADSCs膜片的構建

1.2.1 ADSCs的分離培養 頸椎脫位處死小鼠，無菌條件下取腹股溝處腹腔內脂肪，膠原酶消化法提取組織細胞。37 ℃，5%CO2細胞孵箱中常規培養48 h換液，以后每3 d換液直至細胞融合80%～90%傳代。

1.2.2 ADSCs膜片的構建 常規培養P3ADSCs至融合90%，加入成膜誘導液(ADSCs完全培養基+50 μg/ml Vit C)，以后每3 d換液。肉眼和倒置顯微鏡下觀察成膜情況。

1.3 CoCl2模擬低氧環境的劑量效應

含不同濃度CoCl2(0、50、100 μmol/L)的完全培養基處理P3ADSCs 48 h。Trizol和RIPA裂解液分別提取總RNA和蛋白，用于qPCR和Western Blot。以β- actin為內參檢測HIF- 1α的表達。反轉錄、qPCR反應體系及條件、抗體稀釋及使用方法參照說明書。引物序列見表 1。

1.4 低氧環境對構建ADSCs膜片的影響

成膜誘導過程中，分別添加0、50、100 μmol/L CoCl2。2 周后，用鑷子將細胞膜片小心揭起，常規處理切片，行組織學染色(HE染色和天狼星紅染色)或TEM觀察。

1.5 低氧環境對ADSCs及其細胞膜片特性和功能的影響

1.5.1 低氧環境對ADSCs干性的影響 不同程度低氧處理P3ADSCs 48 h，qPCR檢測干性相關基因Sox2，Oct4的表達情況。方法同上；引物序列見表 1。

1.5.2 低氧環境對ADSCs細胞膜片分泌功能的影響

成膜誘導1 周，期間施以不同濃度CoCl2處理，qPCR檢測膠原Col- Ⅰ、粘附分子Cdh1、保護性生長因子bFGF和VEGF。方法同上；引物序列見表 1。

1.6 統計學分析

用SPSS 19.0軟件進行統計分析。多樣本間比較采用單因素方差分析；檢驗水準為P<0.05。

表 1 qPCR引物序列

2 結 果

2.1 ADSCs和ADSCs膜片的形態學觀察

2.1.1 ADSCs形態學觀察 倒置顯微鏡下，分離培養獲得的第三代細胞為貼壁良好的梭形、三角形或多角形細胞(圖 1A)。

2.1.2 ADSCs膜片形態學觀察 隨成膜誘導時間的延長，培養板底部透明性逐漸降低而呈乳白色，誘導10 d左右，膜片邊緣開始向中部蜷曲；14 d后，可用鑷子將之完整揭下。揭下的膜片縮卷成團(圖 1B、C)。倒置顯微鏡下，膜片中ADSCs 形態狹長；密集生長而排列成束(圖 1D)。

2.2 CoCl2體外模擬缺氧環境具有劑量效應

qPCR和Western Blot結果顯示，同常氧對照組相比，CoCl2模擬低氧組高表達HIF- 1α且其表達量隨CoCl2濃度的增加而升高(圖 2)。

2.3 體外低氧環境對構建ADSCs膜片的影響

2.3.1 組織學染色結果 HE染色可見，成膜誘導2 周后，ADSCs形成了“細胞-膠原纖維-細胞”的三明治樣結構。而CoCl2模擬低氧組形成的細胞膜片明顯較對照組薄，主要表現為中間層膠原成分減少，而細胞數量未見明顯改變(圖 3A～C)。天狼星紅染色(圖 3D～F)結果類似，即低氧組膠原減少。

2.3.2 TEM觀察結果 常氧膜片組ADSCs胞漿和ECM中均有大量絲狀膠原纖維(圖 4A、D)。而低氧組明顯減少，且缺氧程度越重(CoCl2濃度越高)越少(圖 4)。但是，相較于對照組，低氧組的細胞連接顯著增加，尤其是輕度缺氧組不僅細胞-細胞、細胞-ECM之間存在大量高密度細胞融合的阻射條帶，同一細胞胞膜反折處也形成密集的點狀或條帶狀連接(圖 4B、E)；高度缺氧組雖較低度缺氧組少，卻仍明顯多于對照組(圖 4C、F)。

圖 2 不同濃度CoCl2作用48 h對HIF- 1α表達的影響

A～C： HE染色(普通光學顯微鏡)； D～F： 天狼星紅染色，粉紅色部分為Ⅰ型膠原(偏振光顯微鏡)

2.4 低氧環境對ADSCs及其細胞膜片功能的影響

2.4.1 低氧環境提高ADSCs干性基因的表達

qPCR結果表明經低氧處理的ADSCs對干性相關基因Sox2和Oct4的表達都明顯上調，且低氧程度越重(CoCl2濃度越高)上調越明顯(圖 5)。

2.4.2 低氧環境減少ADSCs細胞膜片中膠原的表達而提高黏附分子的表達 同TEM觀察結果一致，低氧組ADSCs膜片對Col- Ⅰ的表達降低，而參與形成黏附連接的主要蛋白成分E- Cadherin(Cdh1)的表達在低度缺氧組提高約1.7 倍，高度缺氧組提高約2.6 倍(圖 5)。

2.4.3 低氧環境促進ADSCs細胞膜片生長因子的表達 同對照組相比，各CoCl2處理組ADSCs細胞膜片對bFGF和VEGF的表達量都升高；且各濃度組兩兩比較均有統計學差異(圖 5)。

圖 4 TEM觀察ADSCs膜片超微結構

圖 5 CoCl2作用48 h對ADSCs干性及功能相關基因表達的影響

3 討 論

干細胞治療在多種醫療領域具有廣闊應用前景，但干細胞移植過程中的細胞流失和死亡極大地限制了療效。細胞膜片技術可解決單細胞移植中細胞流失問題[4-5]；而眾多關于干細胞龕的研究也提示從體外到體內的驟然缺氧可能是導致移植干細胞死亡的主要原因[14]。本研究利用CoCl2在體外模擬體內低氧環境，探討其對ADSCs膜片構建和生物學特性的影響。

HIF- 1α是組織低氧的標志物[15]；而Co2+可通過細胞內離子置換使亞鐵螯合酶失活、抑制細胞氧化反應，從而達到模擬細胞缺氧的目的[16]。用梯度濃度的CoCl2處理ADSCs，結果發現隨著CoCl2濃度的增加，ADSCs對HIF- 1α的表達的上調也越明顯，說明CoCl2能有效模擬低氧環境且具有劑量依賴性。

常氧條件下Vit C法能便捷地構建細胞密集排列且富含ECM的ADSCs膜片[17]，在成膜誘導2 周時即可從培養皿中完整揭下。低氧環境中誘導相同時間后，由于ADSCs合成分泌的Col- Ⅰ減少，導致形成的膜片相對較薄；但膜片中細胞數量并不減少且細胞連接更緊密，標志著其抵抗外源性破壞的能力增強。

CoCl2使ADSCs干性基因表達上調，提示低氧微環境更利于維持干細胞未分化特性；低氧下誘導形成的ADSCs膜片合成更多保護性生長因子(bFGF，VEGF)，意味著該膜片在植入體內時可能具有更強的生存能力。

綜上所述，在適當低氧環境下誘導形成的ADSCs膜片用于再生醫療可能會獲得更好的臨床效果。