SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體蛋白抑制對tau蛋白及p38 MAPK通路的影響及其與AD發病機制的關系

周 飛， 李 毅， 吳昌學， 官志忠， 齊曉嵐

SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體蛋白抑制對tau蛋白及p38 MAPK通路的影響及其與AD發病機制的關系

周 飛， 李 毅， 吳昌學， 官志忠， 齊曉嵐

目的 研究α7尼古丁受體(nAChR)蛋白抑制對SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化水平的影響及其與p38 MAPK通路的關系，探討α7 nAChR調節tau蛋白磷酸化的相關機制。方法 用α7 nAChR阻斷劑MLA阻斷SH-SY5Y細胞α7 nAChR蛋白的活化及其表達，用p38 MAPK阻斷劑SB203580阻斷SH-SY5Y細胞p38 MAPK信號通路蛋白的活化及其表達，Western blotting方法測定tau蛋白、p-tau (S404)、p-tau (S214)、α7 nAChR、p38 MAPK及p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白表達水平。結果 細胞經MLA處理后，p-tau (S404)和p-tau (S214)蛋白水平明顯升高(P<0.01)，p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平明顯降低(P<0.01)，tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平保持不變；經SB203580處理后,SB203580及MLA共同處理后均引起p-tau (S404)、p-tau (S214)、p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平顯著降低(P<0.01)，tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平無變化。結論 α7 nAChR可通過阻斷p38 MAPK信號傳導通路抑制tau蛋白過度磷酸化。

阿爾茨海默?。?tau； α7 nAChR； p38 MAPK

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的神經系統退行性疾病，以近期記憶障礙、認知下降及慢性、持續性癡呆為主要特征，發病率在國內外研究中顯示為5%左右[1]。病理學上以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques,SPs)以及tau蛋白過度磷酸化引起的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)為主要特征[2]。在AD病理發展研究中尼古丁乙酰膽堿能受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)涉及頗多，而其作用性質存在爭議，研究報告顯示，nAChRs活化既可增加也可降低tau蛋白磷酸化水平[3,4]，機制尚不清楚，p38依賴性尼古丁可通過抑制BAG2內源性表達，導致tau磷酸化水平增加，過度表達BAG2又可降低尼古丁誘導的tau蛋白磷酸化水平[5]。nAChRs與AD病程發展關系密切，對指導AD治療有一定作用[6]。其中α7 nAChR是分布最廣的亞單位之一[7]，在AD病變中，α7 nAChR能同時發揮神經保護及神經營養作用[8]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路主要由活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，其中p38 MAPK參加調節神經細胞存活的整個生命過程。激動α7 nAChR，Ca2+通透性增加，p38 MAPK通路被激活[9]，刺激炎性因子，促使神經細胞大量壞死、凋亡[10]。本實驗將針對AD中α7 nAChR調節tau蛋白磷酸化的作用機制來展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的SH-SY5Y神經細胞由本課題組保存；DMEM培養基、血清、0.25%胰酶均來源于Hyclone公司；兔抗人tau單克隆抗體(ab32057)、兔抗人p-tau(S404)單克隆抗體(ab92676)、兔抗人p-tau(S214)多克隆抗體(ab10891)均購于英國Abcam公司；兔抗人p38 MAPK單克隆抗體(8690s)、兔抗人p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)單克隆抗體(4511s)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(7074s)、SB203580(5633s)均購于美國Cell Signaling公司；兔抗人α7 nAChR多克隆抗體(sc-5544)購于美國Santa公司；鼠抗人Actin 單克隆抗體(m20010)購于美國Abmart公司；辣根酶標記的羊抗鼠二抗(ZB2305)來源于中杉金橋公司；Methyllycaconitine citrate(MLA)(1029-5)來源于英國Tocris公司；蛋白Marker來源于美國Thermo公司；5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞計數試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購自日本Dojindo公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均來源于北京索萊寶公司；PVDF膜、ECL-Plus發光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SH-SY5Y細胞以DMEM為培養基，其中添加10%血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)，放入37 ℃含5% CO2恒溫箱中進行孵育。

1.2.2 實驗分組 為了研究p38 MAPK信號通路對α7 nAChR調節tau蛋白磷酸化水平的影響，細胞依次分為對照組、MLA處理組、SB203580處理組、SB203580+MLA組共4個組。第1組細胞不處理，為空白對照;第2組(源于參考文獻[11])細胞給予5 μmol/L的MLA處理24 h;第3組(CCK-8篩選條件)細胞給予160 μmol/L的SB203580處理1 h;第4組細胞給予160 μmol/L的SB203580預處理1 h后，加入5 μmol/L的MLA處理24 h。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.3 CCK-8法檢測SH-SY5Y細胞活力 用含10%胎牛血清的DMEM培養基將經胰酶消化后的SH-SY5Y細胞吹打混勻成單細胞懸液，以密度為104/孔接種于96孔板中(邊緣孔用單純DMEM培養基填充，可作為空白孔)，每孔定容100 μl，每組復孔6個，放入培養箱孵育，待細胞生長至孔底80%～85%時，吸掉培養基，每孔加入DMEM培養液100 μl進行饑餓處理，12 h后吸掉單純培養基，根據實驗設計每組加入濃度分別為0 μmol、20 μmol、40 μmol、80 μmol、160 μmol、320和640 μmol/L的SB203580(用DMEM稀釋)，孵育1 h后吸掉培養基，終止藥物作用，同時周邊空白孔也吸掉原DMEM培養液，最后均加入含10%CCK-8的DMEM培養基，每孔100 μl，于恒溫箱中繼續孵育，1 h后用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度(A)值，并根據公式：細胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)，計算各組細胞存活率。

1.2.4 Western blotting檢測SH-SY5Y細胞中p38、p-p38、α7 nAChR、tau、p-tau (S214)、p-tau (S404)蛋白水平 經不同藥物處理后，按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制細胞裂解液，分別收集細胞，冷凍離心12000 r、4 ℃、15 min，汲取上清蛋白。采用BCA定量法測定蛋白濃度；運用Western blotting法檢測細胞中p38、p-p38、α7 nAChR蛋白表達情況，以驗證相應藥物對SH-SY5Y細胞作用條件的篩選；檢測細胞中tau、p-tau (S214)、p-tau (S404)蛋白表達情況，觀察藥物作用蛋白對tau蛋白磷酸化水平的影響。運用Image J 軟件進行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內對照，分別計算p38、p-p38、α7 nAChR、tau、p-tau(S214)、p-tau(S404)蛋白條帶相對其內參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達水平。每組蛋白復孔3個，重復3次獨立實驗。

2 結 果

2.1 不同濃度SB203580對SH-SY5Y細胞活力的影響 將SH-SY5Y細胞分別與濃度為0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L和640 μmol/L的SB203580共同孵育1 h后加入CC-8進行檢測，結果(見圖1)。經不同濃度的SB203580處理后，細胞活力值逐漸下降且呈現劑量依賴性關系，在20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L SB203580作用時，細胞活力降低，但與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05);隨著SB203580濃度的增加，細胞活力明顯下降，160 μmol/L、320 μmol/L和640 μmol/L組的細胞活力分別是對照組的83%(P<0.05)、50%(P<0.01)和5%(P<0.01)，說明后3組濃度的SB203580處理細胞，與對照組相比，差異具有統計學意義，因為其中160 μmol/L是使細胞活力下降最低也即相對存活率最高的濃度，因此后續實驗使用的SB203580濃度均為160 μmol/L。

2.2 SB203580對p38 MAPK信號通路蛋白水平的影響 將SH-SY5Y細胞與濃度為160 μmol/L的SB203580共同培養1 h后，檢測p38及p-p38蛋白表達情況，結果顯示，與對照組相比，p38(見圖2A)蛋白質水平保持不變，p-p38(見圖2B)蛋白質水平降低了66%(P<0.01)。說明160 μmol/L的SB203580作用SH-SY5Y細胞1 h，p38 MAPK信號通路被明顯阻斷。

2.3 MLA對α7 nAChR蛋白水平的影響 將SH-SY5Y細胞與濃度為5 μmol/L的MLA共同培養24 h后，檢測α7 nAChR蛋白表達情況；結果顯示，與對照組相比，MLA處理組α7 nAChR(見圖3)蛋白質水平降低了75%(P<0.01)。說明5 μmol/L的MLA作用SH-SY5Y細胞24 h，α7 nAChR被明顯抑制。

2.4 α7 nAChR蛋白抑制對tau蛋白磷酸化水平的影響及其與p38 MAPK通路的關系 SH-SY5Y細胞按MLA組、SB203580組、SB203580+MLA組分別加藥處理后，共同檢測α7 nAChR蛋白、p38通路蛋白、tau及其磷酸化蛋白水平的變化；結果顯示，與對照組相比，此3組分別引起α7 nAChR(見圖4A)蛋白水平降低了79%(P<0.01)、64%(P<0.01)、65%(P<0.01)，引起p-p38(見圖4B)蛋白水平分別降低了66%(P<0.01)、82%(P<0.01)、80%(P<0.01)，引起p-tau(S404)(見圖4C)蛋白水平依次升高了62%(P<0.01)、降低了77%(P<0.01)和70%(P<0.01)，引起p-tau(S214)(見圖4D)蛋白水平依次升高了78%(P<0.01)、降低了71%(P<0.01)和79%(P<0.01)，tau蛋白(見圖4E)和p38(見圖4F)蛋白水平無變化。說明p38 MAPK通路被阻斷可引起tau蛋白磷酸化水平顯著降低，α7 nAChR蛋白表達抑制可導致tau蛋白磷酸化水平明顯升高，而預先用p38 MAPK阻斷劑處理后，α7 nAChR誘導的tau磷酸化水平明顯降低，說明α7 nAChR可通過阻斷p38 MAPK信號通路抑制tau蛋白過度磷酸化；但與單純通路抑制組相比，通路及受體同時被抑制后引起的tau蛋白磷酸化水平降低程度無明顯差異，說明在對tau蛋白磷酸化調節中p38 MAPK通路阻斷作用可能遠大于受體抑制作用。

與對照組比較，具有統計學價值*P<0.05；與對照組比較，具有高度統計學價值**P<0.01

圖1 CCK-8檢測不同濃度SB203580對SH-SY5Y細胞活性的影響

與對照組比較，具有高度統計學價值**P<0.01

圖2 SB203580對細胞p38(見圖2A)、p-p38(見圖2B)蛋白水平影響

與對照組比較，具有高度統計學價值**P<0.01

與對照組比較，具有高度統計學價值**P<0.01

圖4 α7 nAChR蛋白及p38 MAPK通路抑制對細胞α7 nAChR(見圖4A)、p-p38(見圖4B)、p-tau (S404)(見圖4C)、p-tau(S214)(見圖4D)、tau(見圖4E)、p38(見圖4F)蛋白水平的影響

3 討 論

AD是影響老人健康、導致生活質量進行性降低且發病年齡在逐步提前的一種危險疾病，因此探究其發病機制、研究有效的防治藥物及針對性解救措施已刻不容緩[12]。在AD病程發展中，神經型尼古丁受體數目明顯減少[13,14]，α7 nAChR對神經系統毒性損傷具有一定的神經保護作用，目前α7 nAChR激動劑在AD治療研究中已處于發展階段，體外實驗發現α7 nAChR活化可明顯改善AD的認知、記憶功能[15]。tau蛋白作為一類細胞骨架蛋白，常表達于神經元，生物學功能重點表現為輔助微管裝置及穩定構造。tau蛋白磷酸化位點，大部分表現為絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)殘基磷酸化，且處于低磷酸化水平，病變時tau蛋白異常磷酸化使微管失去穩定性，游離tau蛋白劇增，彼此聚集，在大腦皮質不斷擴散，與AD病程發展密切相關[16]。研究顯示tau蛋白Ser396、Ser202、Thr231位點高度磷酸化可形成NFTs，導致神經病變[17]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)傳導通路是主要的基本信息傳遞鏈之一，激活p38 MAPK可引起神經系統tau過度磷酸化[18]，微管穩定性下降及微管重排，抑制p38通路可抵抗Aβ誘導的神經毒性[19]，抑制海馬體p38 MAPK表達可明顯改善記憶、認知功能和突觸可塑性，因此p38 MAPK可能是治療認知功能障礙性疾病的一個潛在靶點[20]。

本實驗主要研究阻斷SH-SY5Y細胞α7 nAChR、p38 MAPK信號通路蛋白表達后tau蛋白磷酸化改變，從而探索尼古丁受體調節AD中tau蛋白磷酸化的作用機制與P38 MAPK信號通路的關系。實驗結果顯示，p38 MAPK通路被阻斷可引起tau蛋白磷酸化水平降低，α7 nAChR蛋白抑制可導致tau蛋白過度磷酸化，與單純受體抑制組相比，預先用p38 MAPK阻斷劑處理后，α7 nAChR抑制誘導的tau磷酸化水平明顯降低，說明α7 nAChR可通過阻斷p38 MAPK信號傳導通路抑制tau蛋白過度磷酸化；但與單純通路抑制組相比，通路及受體同時被抑制后引起的tau蛋白磷酸化水平降低程度無明顯差異，說明一旦p38通路被阻斷，α7 nAChR可能無法發揮常規效應，其神經毒性反而會因通路預先阻斷而受到抑制，因此在對tau蛋白磷酸化影響中p38 MAPK通路阻斷作用可能遠大于受體抑制作用。另外，單獨用p38阻斷劑處理及兩種阻斷劑合用后，受體蛋白水平都下降，而tau磷酸化水平也下降，說明阻斷p38 MAPK通路可能降低α7 nAChR水平，且該作用遠不及通路抑制后本身所具有的效應，所以p38 MAPK信號傳導通路被阻斷可能在調節tau蛋白磷酸化水平過程中發揮著主導作用，成為一個重要調控點。

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Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor protein expression on tau protein and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells and the relationship with the pathogenesis of AD

ZHOUFei,LIYi,WUChangxue,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the influence of inhibited protein expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on tau phosphorylation and the relationship with p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells,to study the effected mechanism of α7 nAChR on tau phosphorylation.Methods SH-SY5Y cells were exposed to MLA and SB203580,respectively,to block the activation and protein expression of α7 nAChR and p38 MAPK pathway.The protein levels of tau,p-tau (S404),p-tau (S214),α7 nAChR,p38 MAPK and p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) were measured by Western blotting.Results As compared with negative controls,in MLA treated group,the expressions of p-tau (S404) and p-tau (S214) were increased and the protein levels of α7 nAChR and p-p38 MAPK were decreased significantly,tau and p38 MAPK protein expressions were unchanged.In SB203580 treated group and both two medicines treated group,the expressions of p-tau (S404),p-tau (S214),α7 nAChR and p-p38 MAPK were both decreased conspicuously,the protein levels of tau and p38 MAPK were still unchanged.Conclusions Blocked p38 MAPK signal transduction pathway can prevent against the α7 nAChR-induced tau hyperphosphorylation.

Alzheimer’s disease; tau; Receptors; Cholinergic; p38 MAPK

2016-12-06；

2017-01-29

國家自然科學基金資助項目(81360178)；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)；貴州省科技廳重大專項[黔科合重大專項字2014(6008)]；貴州省科技廳項目[201344，黔科合SY字(2013)][3020黔科合LH字(2016)7365]

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州醫科大學地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail:xiaolan76@163.com

1003-2754(2017)02-0137-04

R749.01

A