雷公藤多甙對致癇大鼠學習記憶及海馬Ng和PKC表達的影響

黃 靈， 黃建敏， 李雪斌， 黃瑞雅， 蒙蘭青

雷公藤多甙對致癇大鼠學習記憶及海馬Ng和PKC表達的影響

黃 靈， 黃建敏， 李雪斌， 黃瑞雅， 蒙蘭青

目的 研究雷公藤多甙(TWP)在戊四氮(PTZ)所致癲癇大鼠學習記憶障礙中的干預作用及可能機制,探討神經顆粒素(Ng)和蛋白激酶C(PKC)在癲癇大鼠海馬組織中的表達的影響。方法 通過水迷宮及Y迷宮篩選方式挑選學習記憶功能正常的SD大鼠90只，隨機分為PTZ致癇組、TWP低劑量組(TWP1)、TWP高劑量組(TWP2)、正常對照組，采用戊四氮(PTZ)腹腔注射慢性點燃癲癇。用水迷宮和Y迷宮對4組大鼠進行學習記憶能力檢測，運用實時熒光定量PCR及酶聯免疫吸附法分別檢測其海馬組織Ng和PKC基因mRNA及相應蛋白的表達水平。結果 與PTZ組相比，TWP干預組大鼠在水迷宮中提高，其學習記憶能力接近NC組(P>0.05)；而4組逃避潛伏期差異無統計學意義(P> 0.05)。在Y迷宮TWP干預組錯誤反應次數比PTZ組明顯減少(P<0.05)，其行為能力接近NC組(P> 0.05)；但4組在全天總反應時間上的差異無統計學意義(P>0.05)。經TWP干預后大鼠海馬Ng和PKC基因mRNA及相應蛋白的表達上調，與PTZ組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，上調水平與NC組接近(P> 0.05)；而TWP1和TWP2兩組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 TWP可有效改善PTZ所致癲癇大鼠的學習記憶能力，這與上調大鼠海馬組織Ng及PKC表達水平密切相關。

戊四氮； 癲癇； 神經顆粒素； 蛋白激酶C； 雷公藤多甙

反復癲癇發作患者常伴有學習及記憶能力等認知功能的障礙，嚴重的影響了生活質量。因此，研究反復癲癇發作致學習記憶障礙的發病機制和探索治療癲癇的新藥物及新方法成為目前癲癇研究中的熱點。Ng作為PKC磷酸化功能的作用底物，參與信號轉導、改變突觸可塑性并在學習記憶過程中發揮重要調控作用[1]。20世紀70年代以后，雷公藤多甙具有較強的抗炎、免疫抑制作用，且能通過血腦屏障，已成功用于類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等自身免疫性炎癥性疾病,且已廣泛應用于臨床，獲得了良好的療效，引起國內外醫藥界的高度重視[2]。目前關于雷公藤多甙干預癲癇大鼠的學習記憶是否有效尚未見報道。本實驗擬雷公藤多甙在戊四氮所致癲癇大鼠學習記憶障礙中的干預作用及可能機制,及探討Ng和PKC在癲癇大鼠海馬組織中的表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠(n=105)購自廣西醫科大學實驗動物中心，大鼠鼠齡為3個月，SPF等級，平均體重為(200±10)g，分籠飼養，條件為：12 hrs光亮/黑暗條件、20 ℃～25 ℃環境溫度。

1.1.2 主要試劑及儀器 雷公藤多甙(浙江得恩制藥有限公司)、DNTP(大連寶生物Takara)、引物(大連寶生物Takara)、總RNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)、大鼠蛋白激酶C(PKC)試劑盒(武漢華美生物工程工程有限公司)、神經顆粒素(Ng)試劑盒 (武漢華美生物工程工程有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國ABI 7500)、紫外分光光度計(美國BIO-Rad)、Morris水迷宮(參照宿寶貴實驗自制)、Y迷宮(張家港市生物醫學儀器廠)等。

1.2 方 法

1.2.1 實驗動物分組及制備動物模型 挑選經水迷宮和Y迷宮實驗合格的大鼠90只進入研究，將所選取的大鼠機隨分為4組：PTZ致癇組(PTZ組，n=25)、TWP低劑量組(TWP1組，n=25)、TWP高劑量組(TWP2組，n=25)及正常對照組(NC組，n=15)，其中前3組為癲癇模型，采用PTZ腹腔注射方式誘導，劑量為35 mg/kg·d，每日晨8：00-9：00一次性給藥，連續用藥28 d；在3組癲癇模型中，TWP1和TWP2組接受TWP干預處理，即在PTZ給藥前30 min，分別給予10 mol/kg·d和30 mmol/kg·d TWP(融于羧甲基纖維素鈉)進行灌胃處理，共用28次。而NC組為非癲癇模型，僅進行生理鹽水處理，劑量與給藥方式同癲癇模型組PTZ。

觀察所有大鼠在每次注射給藥后1 h內的行為變化。根據Racine分級標準將其行為分為6級，具體如下：0級，無任何反應，呈正常的行為狀態；Ⅰ級，濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節律性咀嚼；Ⅱ級，頸部肌肉痙攣表現為點頭和(或)甩尾；Ⅲ級，一側前肢陣攣；Ⅳ級，雙側前肢陣攣伴站立；Ⅴ級，全身陣攣，失去平衡，跌倒。在第29～33天和第34～35天，實驗動物相繼進行水迷宮及Y迷宮測試以分析學習記憶能力；在第36天，通過手術取實驗動物的海馬組織以檢測和分析Ng與PKC的基因及蛋白表達情況。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測Ng和PKC mRNA的表達水平 用Trizol提取大鼠海馬組織的總RNA,紫外分光光度計測定RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。 再以SYBR Green體系為熒光標記物，在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應。以β肌動蛋白(β-action)為內參照mRNA。PKC上游引物5’-AAATCCGGGCTCCCACATC-3’,下游引物5’-CGGGATGAGCTTCAGTTTCACATA-3’,擴增片段116 bp；Ng上游引物5’-CCTGAACTACCACCCAGCATTG-3’，下游引物5’-TAGAATATCGTCGTCTGGCTTGGA-3’，擴增片段134 bp。50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min預變性后，95 ℃ 15 s 和60 ℃ 60 s共40個循環。用2-△△CT法進行相對定量分析。

1.2.3 ELISA法檢測Ng和PKC的蛋白表達水平 取海馬組織稱重，把海馬組織剪切成細小的碎片，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測Ng和PKC的蛋白的表達。

2 結 果

2.1 水迷宮實驗檢測結果 在5個訓練日中各組平均潛伏期的差異并無統計學意義(P>0.05)，PTZ組大鼠的平均運行時間較NC組顯著延長(P<0.05)，而正確率卻明顯降低(P<0.05)，說明癲癇致使大鼠學習記憶能力顯著受損。在給予TWP干預處理后，癲癇大鼠運行時間出現縮短(P<0.05)，而正確率提高(P<0.05)，但這種作用無劑量依賴關系(P>0.05)(見表1)。

2.2 Y迷宮實驗檢測結果 PTZ組大鼠的錯誤反應次數與NC組比較明顯升高(P<0.05)；TWP1組和TWP2組的錯誤反應次數與PTZ組比較明顯下降(P<0.05)，TWP1組和TWP2組與NC組比較無顯著性差異(P>0.05)；TWP1組和TWP2組也無顯著性差異(P>0.05)。全天總反應時間(total reaction time,TRT)4組分別為：4組比較無顯著性差異(P>0.05)。結果提示癲癇大鼠的記憶成績降低，雷公藤多甙可以改善其學習記憶成績(見表2)。

2.3 各組大鼠海馬內NgmRNA、PKC mRNA的表達 與NC組比較，PTZ組Ng與PKC基因的mRNA表達下調，但當給予TWP干擾處理后，Ng與PKC表達開始回升約50%～70%，接近正常，值得注意的是我們并沒發現TWP對PKC基因的mRNA表達調控的劑量依賴性(P>0.05)(見表3、表4)。

2.4 大鼠海馬Ng與PKC蛋白表達檢測結果 PTZ組較對照組Ng與PKC蛋白表達下調，在加入TWP后蛋白表達出現回調達1.5～1.7倍(P<0.05)，但TWP的上調Ng與PKC作用無劑量依賴性(P>0.05)(見表5)。

表1 水迷宮實驗平均逃避潛伏期、平均運行時間、正確率的比較(±s)

與NC組比較*P<0.05；TWP1及TWP2與PTZ組比較#P<0.05

表2 大鼠錯誤反應次數和全天總反應時間(±s)

與NC組比較*P<0.05；TWP1及TWP2與PTZ組比較#P<0.05

表3 各組大鼠海馬內NgmRNA的相對含量比較(±s)

與NC組比較*P<0.05；TWP1及TWP2組與PTZ組比較#P<0.05

表4 各組大鼠海馬內PKC mRNA的相對含量比較(±s)

與NC組比較*P<0.05；TWP1及TWP2組與PTZ組比較#P<0.05

表5 ELLSA檢測各組Ng與PKC含量(±s)

與NC組比較*P<0.05；TWP1及TWP2組與PTZ組比較#P<0.05

3 討 論

雷公藤多甙是從中藥雷公藤的根芯部分提取的有效成分，其主要含有雷公藤內酯二醇(T8)、雷醇內酯(T9)、雷公藤紅素及雷公藤氯內酯醇(T4)，雷公藤多甙在保留了雷公藤生藥療效的同時安全性提高了一倍以上[3]。近年來，對雷公藤多甙的研究中，發現其可能具有改善學習記憶的作用。施麗艷等[4]發現在AD大鼠模型中，雷公藤紅素對認知功能障礙具有明顯的保護作用。另外，研究已證實雷公藤多甙具有對神經系統損害的毒副作用，如抽搐和煩躁等。它的毒副作用的發生與損害的嚴重程度與雷公藤多甙提取物的劑量相關。鮑育華等[5]研究顯示,雷公藤紅素在60 μg/kg時具有神經元保護作用,能夠改善手術創傷刺激引發的老年鼠認知功能的降低。關于雷公藤提取物對神經系統直接的毒理學研究目前尚無報道。但余昌胤[6]等研究發現雷公藤多甙能改善慢性腦低灌注大鼠學習記憶能力，這種作用在高劑量和低劑量間差異無顯著性意義。本實驗采用檢測學習記憶的理想方法水迷宮和Y迷宮，分別從空間學習記憶和逃避性記憶對大鼠進行行為學檢測，結果表明在水迷宮中PTZ致癇組的學習記憶受損表現為運行時間延長、錯誤次數增加，TWP1和TWP1較PTZ組運行時間縮短、錯誤次數減少，TWP1、TWP1之間無顯著性差異；在Y迷宮實驗中PTZ致癇組錯誤反應次數增多，雷公藤多甙干預各組較PTZ致癇組減少，TWP1和TWP1之間無明顯差異。行為學測試說明結果戊四氮點燃慢性癲癇大鼠確實存在空間學習記憶功能障礙，雷公藤多甙對大鼠腦組織損傷所造成的學習記憶障礙有保護作用，雷公藤多甙兩種劑量干預效果一致，其機制有待進一步研究。

Ng是神經元特異性的突觸后膜蛋白,在大腦內表達豐富，廣泛分布于海馬、前額皮質、紋狀體和杏仁核等重要腦區，這些部位是學習和記憶功能重要的腦結構基礎。Ng基因敲除小鼠在健康狀態、神經反射、感覺和運動方面表現正常，但在學習、記憶及PKC細胞信號系統等方面明顯受損[7]。徐天勇等[8]發現慢性應激致使皮質、海馬、下丘腦神經元細胞Ng蛋白含量下降，進而致使神經元細胞數量減少伴突棘數量減少，突觸可塑性的損害造成大鼠水迷宮實驗潛伏期延長，外顯為學習記憶能力的降低。

蛋白激酶C是一組具有單一肽鏈結構的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是機體細胞信號傳導通路的中心環節，它廣泛分布于哺乳動物各種組織中，其中以腦組織中含量最豐富[9]。PKC家族調節細胞增殖分化、神經發生和中樞神經系統發育等一系列過程，己經證實其在突觸可塑性、長時程記憶增強和長時程記憶減低過程中起重要作用[10]。Ng與PKC有密切的關系。Ng作為PKC的天然作用底物，生理狀態下，Ng與CaM結合形成復合體，當神經沖動引起NMDAR活化，使與受體偶聯的Ca2+通道開放時，細胞內Ca2+濃度升高，Ng與CaM復合體解離，游離的Ng被PKC磷酸化，磷酸化的Ng與CaM的親和力降低，使細胞內的Ca2+與CaM復合體濃度增加，進而激活Ca2+和CaM依賴性酶，如CaMKII等，而這些酶大都參與LTP的誘導和維持[11]。

我們用實時熒光定量PCR及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的方法，從觀察癲癇后海馬Ng及PKC的mRNA和蛋白表達變化入手，結果發現癲癇后PTZ組海馬區Ng和PKC的mRNA水平下降，蛋白表達減少，Ng的結果與國內研究一致[12]。推測癲癇發作后導致缺血、缺氧、水腫以及興奮性氨基酸毒性等，鈣泵功能受損，不能泵出胞漿內過多Ca2+，導致神經元鈣超載。鈣超載在癲癇腦損傷中起著關鍵性作用[13]，病理狀態下細胞內鈣超載可造成一系列代謝紊亂[14]。鈣穩態的失衡導致PKC的活性降低，PKC的水平也降低，使Ng的磷酸化和去磷酸化失衡，胞內游離CaM減少，進而影響CaM與Ca2+的結合，這樣也影響了包括LTP形成的重要蛋白激酶-CaMKⅡ；Ng表達的降低也影響了與之結合的CaM，CaMKⅡ的活性也可能受到影響；而CaMKⅡ的表達降低會直接影響CaMKⅡ的活性。由此推測這些因素有可能引起CaMKⅡ的活性下降，抑制了LTP的形成，從而造成學習記憶功能的障礙。為更深入了解雷公藤多甙對Ng和PKC基因的mRNA和蛋白表達調控的有無劑量依賴性，本實驗用雷公藤多甙干預癲癇大鼠采用低劑[10 mmol/(kg·d)]和高劑量[30mmol/(kg·d)]兩種劑量。結果顯示TWP1和TWP2 Ng和PKC的mRNA及蛋白表達較PTZ組升高，有統計學意義，但在TWP1組和TWP2組間差異無顯著性意義，且水平接近NC組。推測其機制可能是雷公藤多甙降低TNF-α、核轉錄因子(NF-κB)的釋放，阻止鈣超載，保護海馬[Ca2+]i水平，增強Ng和PKC的mRNA及蛋白表達水平，LTP得以形成，促進學習記憶功能好轉。本實驗發現TWP1組和TWP2組大鼠的Ng和PKC的mRNA及蛋白表達差異無顯著性，推測雷公藤多甙10 mmol/(kg·d)已達到改善癲癇大鼠學習記憶能力的最大劑量。觀察其治療效果，探討雷公藤多甙改善癲癇大鼠學習記憶能力的最佳有效劑量，并進一步完善相關作用機制的研究，為雷公藤多甙治療反復癲癇后認知功能障礙提供理論基礎。另外，實驗中觀察到，TWP1組和TWP2組并不能抑制癲癇大鼠的發作，且高劑量組大鼠癲癇發作數較低劑量高，推測這可能與雷公藤多甙的神經系統毒副作用有關，也說明雷公藤多甙10 mmol/(kg·d)已達到改善癲癇大鼠學習記憶能力的最大劑量。

綜上所述，雷公藤多甙對改善癲癇所致學習記憶能力的障礙具有一定的防治作用，其機制可能雷公藤多甙與增強Ng和PKC的mRNA及蛋白表達水平，LTP得以形成，進而促進學習記憶能力好轉。

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Tripterygium Wilfordii Polyglycoside:Effects on the learning and memory of rats with epileptisy and the expression of neurogranin and Protein Kinase C

HUANGLing,HUANGJianmin,LIXuebin,etal.

(DepartmentofInternalNeurology,AffiliatedHospitalOfYoujiangMedicalUniwersityForNationalities,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the roles of Tripterygium Wilfordii Polyglycoside (TWP) in the learning and memory of rats having epileptisy induced by pentylenetetrazole (PTZ) and the effects of Neurogranin (Ng) and Protein Kinase C (PKC) expression and to explore the possible association among TWP,PTZ,and epileptisy.Methods Through the water maze and Y maze were selected with normal learning and memory function of 90 SD rats were randomly divided into PTZ group,TWP of epilepsy induced by low dose group(TWP1),high dose of TWP group(TWP2) and normal control group,and with four nitrogen (PTZ) by intraperitoneal injection of chronic model epilepsy.Water maze and Y maze learning and memory ability of detection of 4 groups of rats by using real-time fluorescence quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay for the expression levels of Ng and PKC gene mRNA in the hippocampus and the corresponding protein were detected respectively.Results Compared with the PTZ group,the rats in the TWP intervention group improved their learning and memory ability close to the NC group (P>0.05),while the groups had no significant difference between the four groups(P>0.05).In the Y maze,the TWP intervention group was significantly less than the PTZ group (P<0.05),and its behavioral ability was close to the NC group (P>0.05),but the difference was not statistically significant (P>0.05) in the total response time of the four groups.The expression of Ng and mRNA in hippocampus of rat PKC gene and corresponding protein TWP after the intervention,compared with PTZ group,the difference was statistically significant (P<0.05),raised the level and close to group NC (P>0.05);while there was no significant difference in TWP1 and TWP2 between the two groups (P>0.05).Conclusion These results suggested that TWP might be able to effectveily improve the learning and memory abiligy of rats featuring epileptisy,possibly correlated with the up-regulation of Ng and PKC gene in the hippocampuse tissues.

PTZ; Epilepsy; Ng; PKC; TWP

1003-2754(2017)02-0122-04

2016-10-11；

2016-11-28

國家自然科學基金項目(No. 81160165)；右江民族醫學院院級課題(No.200958);廣西桂西高發病防治研究重點實驗室項目資助(桂教科研2014)6號；廣西臨床重點專科項目資助(桂教科研2013)16號

(右江民族醫學院附屬醫院神經內科，廣西 百色 533000)

黃建敏，E-mail：bshuangjianmin@126.com

R742.1

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