急性腦梗死患者體內血小板CD62P和sTLT-1的表達水平

陸麗麗， 劉 丹， 龐春燕， 張 偉， 張廣煒

急性腦梗死患者體內血小板CD62P和sTLT-1的表達水平

陸麗麗， 劉 丹， 龐春燕， 張 偉， 張廣煒

目的 大量研究表明血小板CD62P和sTLT-1能夠促進動脈粥樣硬化性血栓的形成，因此我們檢測急性腦梗死患者體內血小板CD62P和sTLT-1的表達水平，以作為評價動脈粥樣硬化性血栓形成的功能指標。方法 選擇急性腦梗死患者(發病時間≤7 d)102例作為病例組，同期選擇來我科就診的非急性腦梗死患者93例為對照組，采用流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測血小板CD62P的表達水平，用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中sTLT-1的表達水平。結果 急性腦梗死組的血小板CD62P和sTLT-1的表達水平均明顯高于對照組(P<0.01)，CD62P和sTLT-1的表達水平與急性腦梗死患者的神經功能缺損程度及梗死灶體積呈正相關；CD62P和sTLT-1之間呈直線正相關(r=0.247，P<0.01)；多元Logistic回歸分析，CD62P和sTLT-1在校正其他相關危險因素后[CD62P(%)OR值=1.102，95%CI：1.062～1.143，P<0.01；sTLT-1(pg/ml)OR值=1.004，95%CI：1.002～1.006，P<0.01]。結論 血小板CD62P和sTLT-1是腦梗死發病的危險因素，可能是急性腦梗死患者體內動脈粥樣硬化性血栓形成的獨立危險因素。

急性腦梗死； 動脈粥樣硬化性血栓形成； 血小板； CD62P； sTLT-1

動脈粥樣硬化性血栓形成是目前公認的腦梗死急性發病的主要原因，不穩定的粥樣硬化斑塊被侵蝕發生破裂后，富含脂質的核心和內皮下膠原等物質會激活血流中的血小板，活化的血小板通過變形、釋放顆粒內容物及合成血管活性物質等作用，招募血流中的白細胞粘附于血管內皮損傷處，粘附的白細胞釋放炎性介質，又可以加重內皮細胞的損傷和釋放血小板活化因子。活化因子作為一種血管活性介質又可促使炎細胞聚集和血小板的活化，如此反復導致局部血栓形成，阻塞血管影響組織供血，發生缺血性疾病。當此過程發生于腦血管內，就會引起腦血管的閉塞，局部腦組織失去血液的供應而發生缺血壞死，出現相應的臨床癥狀。

本實驗涉及的指標CD62P是表達于活化血小板表面的膜結合蛋白，是經典的血小板活化指標；髓樣細胞觸發受體樣轉錄因子-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-like transcript 1，TLT-1)是儲存于血小板和巨核細胞α-顆粒內的具有單一V形免疫球蛋白結構域的Ⅰ型孤兒受體，當血小板被激活時，α-顆粒會與血小板膜融合使TLT-1轉移到血小板的表面，血小板表面的TLT-1會分泌一種可溶性的片段(sTLT-1)，并通過sTLT-1發揮作用。大量研究表明血小板CD62P和sTLT-1與動脈粥樣硬化的發生和發展有關，因此我們欲檢測急性腦梗死患者體內血小板CD62P和sTLT-1的表達水平，探討其與急性腦梗死患者體內動脈粥樣硬化性血栓形成之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇急性腦梗死(發病時間≤7 d)患者102例作為病例組，男性66例，女性36例，平均年齡(62.03±8.95)歲。均符合1996年全國第四屆腦血管病學術會議修訂的動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標準，且經頭部CT或MRI檢查證實。排除標準：年齡≤30歲或≥90歲；有嚴重的肝腎功能損害；合并急性心肌梗死、心力衰竭；合并全身自身免疫性疾病、慢性炎癥、嚴重感染、腫瘤或傳染性疾病；有腦出血等出血史或出血傾向，血小板計數<100×109/L或>300×109/L；入院前2 w服用抗血小板聚集、抗凝藥物。同期選擇來我科就診的非急性腦梗死患者93例為對照組,男48例，女45例，平均年齡(59.61±11.26)歲。

1.2 方法與分組 (1)根據頭部CT或MRI病灶大小,腦梗死體積按Pullicino公式(長×寬×層數)/2計算，將其分為大梗死組17例，病灶體積>10 cm3；中梗死組15例，病灶體積(4～10 cm3)；小梗死組70例，病灶體積<4 cm3。(2)根據美國國立衛生院神經功能缺損評分(NIHSS)標準在入院第一天進行評分，分為輕度組44例(<4分)；中度組45例(4～10分)；重度組13例(>10分)。(3)所有入組患者均于入院后由護士急抽肘靜脈血4 ml置于全塑枸櫞酸鈉抗凝管中，在常溫環境中以2500 r/min離心5 min，吸取上層血漿收集于流式管內，加入1%多聚甲醛的PBS液1 ml進行固定(此過程必須控制在30 min內)，然后加入相應抗體等處理后，在24 h內用流式細胞儀檢測血小板CD62P的表達水平。另4 ml置于全塑真空干管內，在常溫環境中以2500 r/min離心5 min，吸取上層血清放于-80 ℃冰箱保存待測，最后用ELISA檢測sTLT-1的表達水平。

2 結 果

2.1 兩組之間一般資料和臨床實驗指標的比較P值來自于獨立樣本t檢驗，結果年齡、性別、血小板計數、TG、CHO、LDL的t檢驗組間P值>0.05，差異無統計學意義；SP、DP、空腹血糖、HDL、CD62P和sTLT-1的t檢驗組間P值<0.05，差異有統計學意義，結果(見表1)。

2.2 CD62P和sTLT-1的表達水平與梗死灶體積的關系 見1.2方法與分組(1)，ANOVA檢驗組間P<0.05，差異有統計學意義；組間兩兩比較示CD62P：P1和P2<0.05(P1小梗死組-中梗死組；P2小梗死組-大梗死組)；sTLT-1：P1、P2和P3<0.05(P1小梗死組-中梗死組；P2小梗死組-大梗死組；P3中梗死組-大梗死組)，差異有統計學意義，梗死灶越大，CD62P和sTLT-1的表達水平越高；其中小梗死組[70例，CD62P(%)=44.82±9.14；sTLT-1 (pg/ml)=530.60±155.88]；中梗死組[15例，CD62P(%)=49.93±9.20；sTLT-1(pg/ml)=600.75±152.90]；大梗死組[17例，CD62P(%)=54.41±8.61；sTLT-1(pg/ml)=735.95±137.65]。

2.3 CD62P和sTLT-1的表達水平與神經功能缺損程度的關系 見1.2方法與分組(2)，ANOVA檢驗組間P<0.05，差異有統計學意義；組間兩兩比較示CD62P：P1和P2<0.05(P1輕度 -中度；P2輕度-重度)；sTLT-1：P1、P2和P3<0.05(P1輕度-中度；P2輕度-重度；P3中度-重度)，差異有統計學意義，神經功能缺損程度越重，CD62P和sTLT-1的表達水平越高；其中輕度組[44例，CD62P(%)=42.31±8.54，sTLT-1(pg/ml)=522.61±151.48]；中度組[45例，CD62P(%)=49.76±9.14，sTLT-1(pg/ml)=577.84±163.71]；重度組[13例，CD62P(%)=54.68±7.30，sTLT-1(pg/ml)=743.60±141.07]。

2.4 Spearman等級相關分析 急性腦梗死患者體內CD62P和sTLT-1的表達水平與神經功能缺損程度呈正相關(CD62P：r=0.518,P<0.01；sTLT-1：r=0.407，P<0.01)；與梗死灶體積呈正相關(CD62P：r=0.429，P<0.01；sTLT-1：r=0.417，P<0.01)。

2.5 Pearson相關分析 急性腦梗死患者體內CD62P與sTLT-1的表達水平呈正相關(r=0.247，P<0.01)。

2.6 將P<0.05的各變量行多元Logistic回歸分析 將單因素方差分析中P<0.05的各變量納入多元逐步Logistic回歸分析，與急性腦梗死明顯相關的變量有HDL、CD62P和sTLT-1，校正其他相關危險因素后，CD62P(%)：(OR值=1.102，95%CI：1.062～1.143，P<0.01)；sTLT-1(pg/ml)：(OR值=1.004，95%CI：1.002～1.006，P<0.01)與急性腦梗死的發病明顯相關，可能是急性腦梗死患者體內動脈粥樣硬化性血栓形成的獨立危險因素。

表1 病例組和對照組的一般資料和臨床實驗指標對比

病例組與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性的血管病變，在動脈粥樣硬化的發生發展中，尤其是在粥樣硬化斑塊的破裂和血栓形成中血小板的活化起著至關重要的作用。動脈粥樣硬化的發生過程包括內皮細胞的損傷、大量脂質在內膜的沉積、固有免疫和適應性免疫反應的增強、血管內膜平滑肌細胞的增殖和細胞外基質的重塑、動脈粥樣硬化性斑塊的形成。血小板內含致密顆粒和α-顆粒，顆粒內含有能夠表達在血小板表面的膜結合蛋白和分泌到細胞外的可溶性蛋白，如纖維蛋白原、CD62P、TLT-1、5-羥色胺(5-HT)、sTLT-1和ADP等物質，血小板的功能也是由這些不同的受體和介質決定的，它們共同作用促進血小板的活化、血小板-白細胞、血小板-內皮細胞以及與其他炎性細胞之間的相互作用。

CD62P又稱為P-選擇素，是細胞粘附分子選擇素家族中的一員。正常情況下CD62P合成并儲存于血小板的α-顆粒和內皮細胞的Weibel-Palade小體內，當機體發生炎癥反應時，在組胺、凝血酶或補體的激活下CD62P會轉移到細胞表面，通過與白細胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)結合，招募循環中的白細胞粘附于血管損傷處，進而促進炎癥反應[1]。有研究表明[2]，CD62P在動脈粥樣硬化的形成和發展中起重要作用，在腦梗死急性期的表達水平明顯高于對照組[3]且與疾病的嚴重程度有關[4]，是腦梗死發生的獨立危險因素，這與本實驗的研究結果是一致的。

sTLT-1是血小板表面的TLT-1發生裂解而生成的是一種可溶性蛋白[5]，當機體發生炎癥性疾病時(如敗血癥)，sTLT-1的表達水平會明顯增高，并通過促進肌動蛋白的聚合而促使血小板粘附于內皮細胞上，因此，sTLT-1是動脈粥樣硬化形成過程中的一個促進因子[6]。Omar LE[7]等研究發現，sTLT-1在急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)患者體內的表達水平明顯增高，且與P-選擇素的表達水平增加同步。這與我們的研究結果是一致的，急性腦梗死患者體內sTLT-1的表達水平明顯高于對照組。sTLT-1與CD62P的表達水平呈正相關，且都是血小板的活化產物，因此我們認為sTLT-1與CD62P一樣在血小板、白細胞、內皮細胞或其他細胞之間起調節作用，是急性腦梗死病情嚴重程度的指標，這也間接表明sTLT-1參與動脈粥樣硬化性血栓的形成。

雖然有研究表明sTLT-1是通過Rac1/p38信號通路調節激動蛋白的聚合[7]，參與斑塊形成和(或)動脈粥樣硬化性血栓形成的病理生理過程。但是sTLT-1參與動脈粥樣硬化性血栓形成的具體機制目前仍不清楚。

[1]Frenette PS,Denis CV,Weiss L,et al.P-Selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) is expressed on platelets and can mediate plateletendothelial interactions in vivo[J].Exp Med,2000,191:1413-1422.

[2]Hu SS,Zhang HG,Zhang QJ,et al.Circulating CD62P small microparticles levels are increased in hypertension[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(8):5324-5326.

[3]Yip HK,Chen SS,Liu JS,et al.Serial changesin platelet activation in patients after ischemic stroke:Role of pharmacodynamic modulation[J].Stroke,2004,35(7):1683-1687.

[4]Cha JK,Jeong MH,Kim EK,et al.Surface expression of P- selectin on platelets is related with clinical worsening in acute ischemic stroke[J].J Korean Med Sci,2002,17(6):811-816.

[5]Jessica M,Karina V,Jim G,et al.Soluble TLT-1 modulates platelet-endothelial cell interactions and actin polymerization[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2010,21(3):229-236.

[6]Morales J,Villa K,Gattis J,et al.Soluble TLT-1 modulates platelet-endothelial cell interactions and actin polymerization[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2010,21(3):229-236.

[7]Omar LE,Robert H,Jose RR,et al.Levels of soluble TREM-like transcript 1 in patients presenting to the emergency department with chest pain[J].Clin Appl Thromb Hemost,2015,21(1):30-34.

The levels of CD62P and Soluble TREM-Like Transcript 1 in patients with acute cerebral infarction

LULili,LIUDan,PANGChunyan,etal.

(DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014010,China)

Objective Recent studies suggest that the CD62P and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-like transcript 1 (sTLT-1) facilitate atherothrombosis.Therefore,We evaluated CD62P and sTLT-1 as functional measures of atherothrombosis in acute cerebral infarction (ACI).Methods The case group includes 102 patients with acute cerebral infarction from department of neurology (within the first 7 days after the onset of stroke),and the control group includes 93 patients with non acute cerebral infarction.The level of CD62P was detected by flow cytometry,the level of sTLT-1 was detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results The level of CD62P and sTLT-1 were dramaticlly higher than the control group(P<0.01).They have obviously positive correlation between degree of neurofunction impairment and volume of infarction.CD62P and sTLT-1 are positive linear correlation(r=0.247,P<0.01).Multivariate analysis showed that CD62P and sTLT-1 are independent indicators of acute cerebral infarction[CD62P(%)OR=1.102,95%CI：1.062～1.143，P<0.01；sTLT-1 (pg/ml)OR=1.004,95%CI：1.002～1.006，P<0.01].Conclusion Platelet activity markers CD62P and sTLT-1 are the risk factor of may be functional measures of acute cerebral infarction and may be independent predictors of atherothrombosis in acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction; Atherothrombosis; Platelets; CD62P; sTLT-1

1003-2754(2017)02-0105-03

2016-10-23；

2016-11-28

內蒙古科技大學包頭醫學院青苗計劃項目(No.2016H0906)

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古 包頭 014010)

陸麗麗，E-mail：823734635@qq.com

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