ADAM10對小鼠顱頜面膜內成骨的影響

譚宇 羅薇 曹海峰 房兵 楊秩

ADAM10對小鼠顱頜面膜內成骨的影響

譚宇 羅薇 曹海峰 房兵 楊秩

目的探索解聚素樣金屬蛋白酶10（ADAM10）對小鼠顱頜面骨骼膜內成骨的影響。方法應用組織免疫熒光染色及蛋白免疫印跡研究ADAM10在小鼠顱頜面骨中的不同時間點、不同部位的表達水平。通過cre-loxp技術在胚胎小鼠顱頜面骨骼中特異性敲除ADAM10基因，應用體視顯微鏡觀察基因敲除小鼠的顱頜面畸形，X線檢查、von Kossa染色檢測基因敲除小鼠骨鈣化情況，雙標免疫熒光觀察基因敲除小鼠骨組織細胞增殖、分化、凋亡能力的改變。結果組織免疫熒光染色顯示小鼠上、下頜骨成骨活躍區ADAM10表達明顯，同時蛋白免疫印跡結果證實，ADAM10在小鼠出生前后表達高，成年后表達明顯降低。大體觀察基因敲除小鼠身體體型較小，顱頜面畸形表現為面中部發育不足，上下頜骨發育不足，顱頂塌陷。X線片檢測及von Kosaa染色顯示基因敲除小鼠全身骨骼密度減低，骨組織形成較弱。免疫熒光檢測發現ADAM10基因敲除小鼠下頜骨細胞增殖、成骨分化能力減低、凋亡增加。結論ADAM10廣泛表達于小鼠膜內成骨區域，可能通過影響骨組織細胞增殖、分化及凋亡來調控小鼠顱面部膜內成骨過程。

解聚素樣金屬蛋白酶10顱頜面骨骼膜內成骨

神經嵴干細胞是一群從神經管側面分化而來的多潛能分化細胞[1]。神經嵴干細胞在顱頜面復合體形成過程中扮演重要角色，可分化為成軟骨細胞、成骨細胞和成牙本質細胞。顱頜面復合體大部分組織主要是通過膜內成骨或軟骨內成骨途徑形成[2]。其中，顱底和下頜骨髁突是通過軟骨內成骨途徑形成；大部分顱頜面骨骼，包括上下頜骨都是通過膜內成骨方式發育形成的。膜內成骨開始于間充質干細胞聚集，細胞分化為定向成骨細胞前體，最終分化為成熟成骨細胞，并形成骨質[3]。既往研究發現，顱頜面骨骼膜內成骨過程，受轉化因子、生長因子、細胞因子和細胞外機制等多途徑調控，但顱頜面骨骼發育的機制仍不清楚。

解聚素樣金屬蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）在神經系統、心血管發育，以及腫瘤、阿茨海默癥等發生中作用重大[4-5]。研究表明，ADAM10在小鼠長骨中顯著表達[6]。ADAM10基因全敲除小鼠在胚胎9.5 d死亡，限制了ADAM10在顱頜面骨骼發育中作用的研究。因此，本實驗使用ADAM10條件敲除小鼠，以探索ADAM10的功能及其在顱頜面膜內成骨中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），由上海交通大學附屬第九人民醫院SPF級實驗動物中心飼養管理[SYXK(滬)2012-0007]。小鼠發育時間按檢到陰栓的當日中午定為胚胎0.5 d。本研究動物實驗嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》（中華人民共和國科學技術部）標準操作。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］、OCT膠（SAKURA公司，日本）、抗ADAM10抗體（Abcam公司，英國）、抗GAPDH抗體（CST公司，美國）、Hoechst（上海碧云天生物技術有限公司）、BrdU（Sigma公司，美國）、Tunel試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）、驢抗小鼠、驢抗兔熒光二抗（Invitrogen公司，美國）。

冰凍組織切片機（SHINVA公司，中國）、體視顯微鏡（Cannon公司，日本）、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）、PCR擴增儀（Roche公司，瑞士）。

1.3Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠的獲得

Wnt1基因為顱神經嵴細胞標志性基因。經由Wnt1-Cre小鼠和ADAM10flox/flox小鼠兩步交配獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠，即表達Wnt1基因的細胞中特異性敲除ADAM10基因的小鼠。第一步，Wnt1-Cre小鼠與ADAM10flox/flox小鼠交配，獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/wt小鼠；第二步，Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠與ADAM10flox/flox小鼠交配，獲得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠。選擇雄性Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠和雌性ADAM10flox/flox小鼠交配，則可獲得穩定的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠群。

1.4 條件性基因敲除小鼠基因型的鑒定

剪取待鑒定小鼠鼠尾約2 mm，提取DNA。在長波紫外光下分析DNA條帶，Wnt1-Cre小鼠基因鑒定結果為500 bp條帶，ADAM10flox/flox小鼠基因鑒定結果為400 bp條帶，ADAM10flox/wt小鼠為一條400 bp條帶和一條200 bp條帶（圖1）。

圖1 條件性基因敲除小鼠基因型的鑒定Fig.1Genotype identification of conditional knockout mice

1.5 實驗動物分組

按基因型鑒定結果，分為顱神經嵴細胞特異性ADAM10條件敲除小鼠，即Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox，以及同窩對照小鼠ADAM10flox/flox兩組。

1.6 小鼠骨組織冰凍切片制備

取小鼠置于冰上處死。小鼠剝皮處理，使用1× PBS心包灌注，沖洗至沖出液呈現透明。4%多聚甲醛灌注固定，至小鼠四肢及尾部僵直，固定24～48 h。30%蔗糖梯度脫水，OCT膠包埋小鼠頭顱，連續切片（厚度30 μm）。切片置于60℃烘箱30 min，待冷卻至室溫，-20℃保存。

1.7 免疫蛋白印跡

取E14.5、E17.5、P0、P7及成年小鼠下頜骨骨組織，液氮中研磨后，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，測量蛋白濃度。配制免疫蛋白印跡凝膠，提取蛋白樣品、電泳、轉膜。封閉非特異性蛋白結合位點，加入封閉緩沖液稀釋的一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入封閉緩沖液稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗，顯色液顯色，膠片顯影，將顯影膠片掃描后使用分析軟件對條帶進行灰度分析。重復實驗3次，統計分析數據。

1.8 免疫熒光

冰凍切片置于搖床上，PBS清洗，5%BSA+3‰Triton封閉打孔，一抗4℃孵育24 h，PBS清洗，加入二抗及Hoechst，37℃避光2 h，PBS避光清洗。熒光封片劑封片，置于-20℃保存。激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

1.9 X線觀察

對E15.5小鼠以5.0 kV、6.0 sec條件拍攝小鼠全身X線片。

1.10von Kossa染色

組織玻片PBS清洗，2%硝酸銀浸染30～60 min，蒸餾水清洗5 min，5%硫代硫酸鈉水溶液處理2 min，自來水清洗5 min，0.1%核固紅染液復染1～2 min，蒸餾水清洗5～10 sec，常規脫水透明，中性樹脂封片后，置通風櫥中干燥。

1.11 統計學分析

所有的數據均獨立重復3次以上，采用兩樣本均數t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義，統計軟件為SPSS Statistics 17.0。

2 結果

2.1 ADAM10在下頜骨發育過程中的表達

免疫蛋白印跡結果顯示，下頜骨中可見ADAM10表達（圖2A），并且ADAM10在胚胎期14.5 d至出生后7 d高表達，成年后表達顯著降低（P＜0.05）（圖2B）。免疫熒光染色顯示，ADAM10在顱頜面骨膜內成骨區域表達明顯，如上、下頜骨區域（圖2C）。

2.2 ADAM10條件敲除小鼠顱頜面骨骼發育異常

選取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠與其同窩ADAM10flox/flox對照小鼠，進行顱頜面的大體形態觀察對比。結果發現，E15.5的Wnt1-Cre/ ADAM10flox/flox小鼠體型較小，面中部及上、下頜骨發育不足，顱頂塌陷（圖3）。

2.3 ADAM10條件敲除小鼠上、下頜骨骨鈣化、骨沉積異常

選取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠與其同窩ADAM10flox/flox對照小鼠的全身X線觀察對比發現，Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠骨骼較小、骨密度降低，兩組差異顯著（圖4A、B）。

von Kossa染色觀察發現類似結果，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠上、下頜骨骨形成區域骨小梁紊亂，上、下頜骨黑色染色區域較少，即成骨組織形成較弱，與對照組相比差異顯著（圖4C、D）。

2.4 ADAM10條件敲除小鼠下頜骨細胞增殖、分化及凋亡異常

通過免疫熒光對Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠及對照組進行成骨分化相關標記物檢測發現，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠在顱頜面的成骨細胞標記物OCN表達降低，成骨分化能力減弱，與對照組相比差異顯著（圖5A、D）。BrdU標記和免疫熒光檢測顯示，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠BrdU陽性細胞數目較少，但與對照組無顯著差異（圖5B、E）。Tunel原位檢測試劑盒檢測小鼠下頜骨組織的細胞凋亡情況，發現Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠下頜骨凋亡細胞明顯增加，與對照組差異顯著（圖5C、F）。

圖2 ADAM10在下頜骨發育過程中的時空表達（*：P＜0.05）Fig.2Expression of ADAM10 in mice during intramembranous ossification(*:P＜0.05)

圖3ADAM10條件性基因敲除小鼠顱頜面發育異常Fig.3Conditional knockout of ADAM10 triggered craniofacial dysmorphia

圖4 ADAM10條件基因敲除小鼠骨密度、骨鈣化降低（*：P＜0.05）Fig.4Reduced maxilla and mandibular calcification in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

圖5 ADAM10條件基因敲除小鼠下頜骨細胞分化、增殖及凋亡能力的改變（*：P＜0.05）Fig.5Cell proliferation,apoptosis and osteoblast differentiation in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

3 討論

本研究中，我們主要探索ADAM10在小鼠顱頜面骨，特別是下頜骨發育中的作用。結果顯示，ADAM10特異性高表達于顱頜面骨骼膜內成骨區域，并且在生長發育不同階段表達量變化顯著。ADAM10條件性敲除小鼠呈現顱頜面骨及軟組織發育異常。細胞學研究表明，ADAM10條件性敲除小鼠下頜骨前成骨細胞成骨能力降低、下頜骨區域細胞凋亡增加。表明ADAM10在顱頜面骨骼發育中具有重要作用。

Dallas等[6]在新生小鼠脛骨中發現，ADAM10特異性高表達于關節軟骨和骨干骺端。本研究有類似發現，ADAM10在上、下頜骨成骨區域特異性高表達，但在成年小鼠中表達顯著降低，提示ADAM10可能參與上、下頜骨膜內成骨過程。

ADAM10功能紊亂可導致多種嚴重病理結果。Isozaki等[7]研究表明，ADAM10在關節炎關節軟骨及癌癥組織中高表達。Woods等[8]發現ADAM10相關的細胞外基質流失，可能促進腫瘤細胞的轉移和遷移。Pliássova等[9]報道，ADAM10與阿茨海默癥發病密切相關。研究表明，ADAM10在中樞神經、心血管系統、小腸及腎皮質等發育中具有重要作用[10-12]。體內實驗發現，ADAM10影響破骨細胞功能，造成骨骼異常[13]。

顱頜面的大部分骨組織都是由顱神經嵴細胞通過膜內成骨發育而來[14]。ADAM10全身敲除小鼠在胚胎期第9.5天死亡，限制了顱頜面骨骼發育的相關研究。既往有研究報道使用Wnt1-Cre轉基因小鼠探索特定基因在顱神經嵴細胞中的作用[18]。因此，本實驗使用Wnt1-Cre轉基因小鼠在神經嵴細胞中特異性敲除ADAM10，研究ADAM10在顱頜面骨骼發育中的作用。

本研究中，實驗組小鼠上、下頜骨長度及寬度與對照組相比均顯著減小。X線檢查發現，實驗組小鼠骨密度明顯降低。von Kossa染色進一步發現，實驗組小鼠上、下頜骨膜內成骨區域骨小梁紊亂。這些結果表明，ADAM10在顱頜面骨骼膜內成骨過程中作用重大。

研究證明，ADAM10對多個系統發育中的干細胞增殖及分化，具有不可忽視的調控作用[15-17]。本研究中，我們通過OCN染色發現，ADAM10基因敲除小鼠成骨細胞分化顯著降低。然而，細胞成骨分化降低并不能完全解釋ADAM10基因敲除小鼠骨骼發育異常。我們進一步研究基因敲除小鼠細胞增殖及凋亡能力的改變，發現基因敲除小鼠下頜骨細胞凋亡顯著增加、增殖能力降低。

綜上所述，本研究證實ADAM10在小鼠顱頜面骨膜內成骨過程中發揮重要作用。敲除ADAM10會影響細胞成骨向分化、增殖及凋亡，進而造成顱頜面骨發育異常。

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[10]Jones JC,Rustagi S,Dempsey PJ.ADAM proteases and gastroin testinal function[J].Annu Rev Physiol,2016,78:243-276.者，則建議采用鼻唇溝皮瓣進行修復。兩種手術方法各有優缺點，臨床上需結合患者實際情況，進行綜合考慮，并慎重選擇。

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（收稿日期：2016年12月21日；修回日期：2016年1月19日）

The Effects of ADAM10 in Craniofacial Intramembranous Ossification of Mice

ObjectiveTo explore the effects of ADAM10 in craniofacial intramembranous ossification of mice.Methods The expression pattern of ADAM10 in mice mandibular was detected by immunofluorescence assay and western blot.Creloxp technique was used to detect the function of ADAM10 in intramembranous ossification areas during craniomaxillofacial development.ADAM10 conditional knock-out mice was evaluated by X-ray and von Kossa staining.The cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were detected by immunofluorescence assay.ResultsImmunofluorescence assay revealed that ADAM10 was primarily distributed in the maxillary and mandibular skeletal genesis zones.ADAM10 was abundantly expressed from E14.5 to postnatal day 7(P7)and was significantly decreased during adulthood.On E15.5,the ADAM10 cKO mice exhibited a shorter snout,flatter posterior skull and smaller maxilla and mandible,compared with the control littermates.The X-ray examination and von Kossa staining shown that the ADAM10 cKO embryos exhibited significantly reduced mineral bone deposition in the maxilla and mandible.Immunofluorescence shown that cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were impaired in ADAM10 cKO mice.ConclusionADAM10,widely expressed in osteogenesis area of mice,can affect the intramembranous bone formation by regulating cell proliferation,differentiation and apoptosis.

ADAM10;Maxillofacial bone;Intramembranous bone formation

R336

A

1673－0364（2017）01－0013－05

TAN Yu1,LUO Wei2,CAO Haifeng3, FANG Bing3,YANG Zhi3．
1 The Second Dental Center,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Department of Orthodontics,Shanghai Stomatological Hospital,Shanghai 200011,China;3 Department of Oral&Cranio-maxillofacial Science,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FANG Bing(E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn); YANG Zhi(E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com).

2016年7月24日；

2016年9月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.004

上海市科委面上項目（14ZR1424100）；國家自然科學基金青年項目（81000451）；上海市衛生局青年科研項目（2010y142）；上海市教委優秀青年教師項目；上海市第九人民醫院優青項目；上海市衛計委青年項目（20154Y0181）；上海市口腔病防治院面上項目（SSDC-2013-01）。

201900上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔第二門診部（譚宇）；200001上海市上海市口腔病防治院口腔正畸科（羅薇）；200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔顱頜面科正頜正畸中心（曹海峰，房兵，楊秩）。

房兵（E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn）；楊秩（E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com）。

注：譚宇、羅薇為共同第一作者。