響應面法優化錦燈籠總黃酮的提取工藝*

閆 平，鄭 蕾，趙 寧，鐘曉瑞

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

錦燈籠是茄科植物酸漿干燥宿萼或帶果實的宿萼，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用，是常用的清熱解毒藥，外治天皰瘡、濕疹[1]，歷代本草多有記載。有報道表明，錦燈籠含有黃酮類化合物[2]。在天然植物中，黃酮類化合物安全、無毒[3]，具有良好的的生物活性[4-5]，如抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎等[6-7]，錦燈籠提取物具有良好的抗腫瘤、抑菌活性等[8]。

關于黃酮類化合物提取、分離及純化方法的研究報道很多，一般采用溶劑浸提法、微波法、超聲波法、超臨界流體萃取法、酶提法、超濾法等[9-13]。作者在前人的研究基礎上，采用響應面法優化錦燈籠總黃酮的提取工藝[14]，為進一步開發錦燈籠藥用資源提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

錦燈籠：購于陜西興盛德藥業有限責任公司，由西安醫學院藥學院生藥教研室馮永輝教授鑒定，經鑒定為PhysalisalkekengiL.Var.franchetii(Mast.) Makino 的干燥宿萼；蘆丁對照品：批號為MUST-12040302，質量分數≥98%，北京恒元啟天化工技術研究院；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、純化水、無水乙醇、甲醇：均為分析純，市售。

紫外-可見分光光度計：UV-160A，上海精密儀器廠；電子天平：SQP，北京賽多利斯科學儀器有限公司；架盤藥物天平：IYT-10，上海光正醫療儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫療儀器廠；循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀：WZ-100，上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

取蘆丁標準品50.00 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加適量甲醇，置水浴上微熱使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取10.0 mL，置100 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

1.2.2 標準曲線的繪制

精密量取標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇至6.0 mL，加質量分數5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質量分數10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加NaOH試液10.0 mL，再加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，用紫外分光光度法在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，以標準品溶液的質量濃度ρ為橫坐標，繪制標準曲線(見圖1)。回歸方程式：Y=11.368X+0.057 5，相關系數R=0.999 5，說明標準品溶液的質量濃度在0.008～0.048 mg/mL與吸光度A具有良好的線性關系。

ρ/(mg·mL-1)圖1 蘆丁標準品曲線

1.2.3 測定樣品中w(總黃酮)

取錦燈籠宿萼干燥粉末10.0 g，精密稱定，用體積分數為80%的乙醇回流提取，將提取液濃縮為浸膏，低溫50 ℃干燥，取濃縮后的提取物總質量的50%，精密稱定，甲醇溶解并定容到100 mL容量瓶中。取錦燈籠提取液1.0 mL，按“1.2.2”項下方法測定吸光度，代入回歸方程中，即可得到錦燈籠中w(總黃酮)。

2 結果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 料液比的選擇

取10.0 g錦燈籠宿萼5份，精密稱量，按照m(錦燈籠宿萼)∶V(乙醇)(g/mL，以下簡稱料液比)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，用體積分數80%乙醇溶液回流提取1 h，提取2次，按照“1.2”項下方法測定w(總黃酮)并計算錦燈籠總黃酮的提取率，結果見圖2。

料液比/(g·mL-1)圖2 料液比對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖2可見，在φ(乙醇)、提取時間、提取次數一定的條件下，料液比1∶10～1∶30時提取率呈先增后減的趨勢，在1∶20時達到最大值，故料液比以1∶20為宜。料液比增大而黃酮含量減小的原因可能是由于其它成分的浸出而影響了總黃酮的提取。

2.1.2 φ(乙醇)的選擇

取10.0 g錦燈籠宿萼5份，精密稱定，按照料液比1∶20，分別用φ(乙醇)=50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液回流提取1 h，提取2次，按照“1.2”項下方法測定w(總黃酮)并計算錦燈籠總黃酮的提取率，結果見圖3。

φ((乙醇)/%圖3 φ(乙醇)對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖3可見，在料液比、提取時間、提取次數一定的條件下，隨著φ(乙醇)的增加，總黃酮的提取率先增后減，當φ(乙醇)=80%時，黃酮提取率最大，故最佳φ(乙醇)=80%。

2.1.3 提取時間的選擇

精密稱取錦燈籠宿萼5份，每份10.0 g，固定料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取次數為2次，提取時間分別為30、45、60、75、90 min進行乙醇回流提取，按照“1.2”項下方法測定w(總黃酮)并計算提取率，結果見圖4。

t/min圖4 提取時間對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖4可見，在固定料液比、φ(乙醇)及提取次數的條件下，隨著提取時間的增加，總黃酮的提取率先增后減，當提取時間為60 min時，黃酮提取率最大，故最佳提取時間為60 min。

2.1.4 提取次數的選擇

精密稱取錦燈籠宿萼5份，每份10.0 g，固定料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取時間60 min，乙醇回流分別提取1次、2次、3次，按照“1.2”項下方法測定w(總黃酮)并計算提取率，結果見圖5。

提取次數圖5 提取次數對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖5可見，在固定料液比、φ(乙醇)及提取時間的條件下，隨著提取次數的增加，總黃酮的提取率成上升趨勢，當提取2次時，黃酮提取率達到最高值，故最佳提取次數為2次。

2.2 響應面法優化實驗

2.2.1 模型建立及顯著性實驗

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素的基礎上篩選出最優水平，以φ(乙醇)(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(D)四個因素為自變量，以w(總黃酮)為響應值Y，采用四因素三水平進行響應面法實驗。響應面因素和水平取值見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

按照Box-Benhnken的中心組合設計方案進行了四因素三水平共29個實驗點的響應面分析實驗，24個實驗點和5個零點對總黃酮的乙醇回流提取工藝進行優化。實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計結果

同時對表2中的數據進行多元回歸分析，其結果見表3。

表3 方差分析結果

1) ***表示差異極顯著(P<0.001)，**表示差異高度顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 響應曲面分析

在其它因素均為零的水平上，分析對總黃酮提取率的影響，選擇φ(乙醇)、料液比、提取時間、提取次數四個變量中的任兩個交互因素進行分析，回歸優化響應面分別見圖6～圖11。

由圖6～圖11可知，此實驗模型都能達到極值點。其中響應面圖坡度越陡對黃酮提取率影響越大，坡度越緩對黃酮提取率影響越小，由以上6個圖綜合可得，四個因素對黃酮提取率影響的順序由大到小為：料液比、φ(乙醇)、提取次數、提取時間。為確定最佳響應值的因素水平組合，利用Design-Expert 8.0.6.1統計軟件進行分析，得出優化條件為：φ(乙醇)=80.24%，料液比1∶20，提取時間1.05 h，提取次數2.06次。考慮實際操作性，將工藝參數更改為φ(乙醇)=80%，料液比1∶20，提取時間1 h，提取次數為2次。

圖6 φ(乙醇)與料液比交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

圖7 φ(乙醇)與提取時間交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

圖8 φ(乙醇)與提取次數交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

圖9 料液比與提取時間交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

圖10 料液比與提取次數交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

圖11 提取時間與提取次數交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應面圖

2.2.3 模型驗證

采用修正后優化工藝參數條件按“1.2.3”項下方法，重復三次實驗，平均w(總黃酮)=2.016 mg/g，此條件下w(總黃酮)的理論預測值為2.109 8 mg/g，兩者相比，相對誤差為2.39%，說明響應面優化法結果可靠，穩定可行。

3 結 論

本研究在單因素的基礎上，通過響應面法考察了料液比、φ(乙醇)、提取時間、提取次數對錦燈籠總黃酮的影響，建立了錦燈籠總黃酮的多元回歸模型，模型擬合度良好。確定了黃酮的最佳提取工藝：料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取時間1 h，提取次數為2次，w(黃酮)可達到2.016 mg/g。單因素影響順序為：料液比>φ(乙醇)>提取次數>提取時間。黃酮提取的實際值與預測值相近，各因素與w(總黃酮)呈顯著的二次拋物關系，表明各交互因素在響應值Y處存在最大值。響應面法優化錦燈籠總黃酮的提取工藝，方法可行，預測性好，得到的工藝條件穩定，為進一步研究錦燈籠提供了可靠的理論依據。

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