4種天麻變型多糖的提取及含量測定

王銳+熊汝琴

摘 要： 通過正交試驗研究天麻多糖的水提條件，并采用蒽酮-硫酸法對4種天麻變型（紅天麻、烏天麻、黃天麻、綠天麻）多糖含量進行測定。結果表明：水提最佳條件為浸提溫度80 ℃，浸提時間3 h，料水比1∶30；含量測定發現，在相同產地、不同天麻變型中的多糖含量不同，其中紅天麻的多糖含量顯著高于其他3種天麻變型，而在不同產地、同一天麻變型中，云南昭通紅天麻的多糖含量遠高于陜西寧強和湖北宜昌的紅天麻，這說明昭通紅天麻具有優良的內在品質。蒽酮-硫酸法為科學評價天麻質量提供了簡便快捷、穩定可行的方法，為昭通天麻資源的開發利用提供了試驗依據。

關鍵詞：天麻；4種變型； 多糖； 正交試驗；蒽酮-硫酸法

中圖分類號： S682.31 文獻標識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.02.003

Abstract： The paper studied the water extraction conditions of polysaccharide of Gastrodia elata Bl. by orthogonal experiment， and determination the content of polysaccharide in four forma of Gastrodia elata Bl. （G. elata Bl. f. elata Bl.， G. elata Bl. f. glauca S. Chow， G. elata Bl. f. flavida S. Chow， G. elata Bl. f. viridis Mak） by the method of anthrone-sulfuric. The results showed that the water extraction optimum conditions were extraction temperature 80 ℃， extraction time 3 h， and the ratio of material to water 1∶30. In the same region， the polysaccharide content in different forma of Gastrodia elata Bl. was different. Among them， the content of G. elata Bl. f. elata Bl. was significantly higher than the other three forma. In different regions， the same forma， the polysaccharide content of G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong， Yunnan was much higher than Ningqiang ，Shanxi and Yichang， Hubei. It showed that G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong had excellent internal quality. The method of anthrone-sulfuric provides a simple， quick， stable， viable method to scientific evaluation of the quality of Gastrodia elata Bl.，and also offers experimental basis for the development and utilization of Gastrodia elata Bl. from Zhaotong.

Key words： Gastrodia elata Bl.； four forma； polysaccharide； orthogonal experiment； the method of anthrone-sulfuric

天麻（Gastrodia elata Bl.）為蘭科（Orchidaceae）天麻屬（Gastrodia）多年生食菌植物，主產于云南、四川、貴州、陜西、湖北等地，其地下塊莖被歷代本草列為上品，在我國已有兩千多年的應用歷史，具有平肝息風止痙的功效，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風。國內外學者對天麻的化學成分及藥理作用已進行了較為系統的研究。其中天麻素（對羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分，其藥理作用與天麻的藥理作用呈正相關，所以多年來把它作為天麻質量優劣的評價標準[1-3]。近年，有研究發現天麻多糖具有清除自由基、降血壓、抗眩暈、免疫調節、抑菌和抑制腫瘤等多種作用[4-5]。植物多糖具有多種生物活性，且毒副作用小，安全性強，常被作為藥材質量的一個指標[6]。

昭通地處云南省東北部，因其得天獨厚的地理、氣候環境所產的天麻享譽國內外，為我國公認的天麻地道產區，產量約占全國1/4，擁有紅天麻（G. elata Bl. f. elata Bl.）、烏天麻（G. elata Bl. f. glauca S. Chow）、黃天麻（G. elata Bl. f. flavida S. Chow）、綠天麻（G. elata Bl. f. viridis Mak）4種天麻變型。本研究通過正交試驗篩選天麻多糖的最佳提取條件，并通過蒽酮-硫酸法測定分析4種天麻變型多糖含量，為天麻不同類型的質量作出科學評價，進一步建全、完善天麻的質量標準，為昭通天麻資源的全面開發利用提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗用4種天麻變型即紅天麻、烏天麻、綠天麻、黃天麻，主產于云南昭通，另有兩種為分別產自湖北宜昌和陜西寧強的外省紅天麻。上述樣品均由昭通市天麻研究所提供鑒定。

蒽酮（國藥集團化學試劑有限公司）；葡萄糖、石油醚（60～90 ℃）、無水乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸等，以上均為分析純（南京化學試劑有限公司）；試驗用水為去離子水（ 18.2 MΩ）。

1.2 儀器與設備

CP214型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；UV/VIS2802PCS紫外-可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；SK5200LHC超聲波洗滌器（上海科導超聲儀器有限公司）；HH-S601型超級恒溫水浴鍋（金壇市岸頭良友實驗儀器廠）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器有限公司）等。

1.3 方 法

1.3.1 樣品的預處理 分別將4種天麻變型干燥塊莖粉碎，過孔徑0.19 mm的篩，各精確稱取2 g天麻粉末置于具塞錐形瓶中，加入30倍體積分數80%乙醇，超聲（53 kHz，250 W）浸提，除去天麻中的脂類、色素、單糖等成分至提取液無色，抽濾、晾干回收天麻粉末。

1.3.2 天麻多糖水提條件的優化 參考文獻[7-8]，確定浸提溫度（A）、料水比（B）、浸提時間（C）為影響因素，每個因素選3個水平（表1），以預處理后的烏天麻做正交試驗提取天麻多糖。將所提物于70 ℃烘干，得天麻粗多糖，稱重計算得率，確定天麻多糖的最佳水提條件。

1.3.3 標準曲線的建立 采用蒽酮-硫酸比色法，在620 nm波長處測定吸光度值[9-10]。精確稱取105 ℃干燥至恒質量的葡萄糖對照品9.6 mg，加水溶解，定容至100 mL，得到0.096 0 mg·mL-1對照品溶液。準確量取對照品溶液0.0，0.2，0.4， 0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并補充去離子水至溶液體積為2.0 mL，充分搖勻。浸入冰水浴中，分別加入2.016 0 mg·mL-1濃硫酸配制的蒽酮顯色劑6.0 mL，搖勻，放入沸水浴，反應15 min后取出，冷卻至室溫。以第一份未加對照品的空白溶液作參比，于波長620 nm處測吸光度值，建立標準曲線。

1.3.4 樣品中多糖含量的測定 將最佳水提條件提取的天麻粗多糖用Sevag試劑（體積比1∶4氯仿正丁醇混合液）除去蛋白，然后加入無水乙醇至乙醇體積分數為80%，充分攪拌，放入冰箱靜置過夜沉淀。沉淀經無水乙醇洗滌，加水稀釋作供試樣品溶液。精確量取供試樣品溶液0.5 mL，按照標準曲線建立方法測定吸光度值，通過以下公式計算樣品中多糖含量。

多糖含量=CVD/W×100%

式中：C為標準曲線回歸方程計算出的多糖質量濃度（mg·L-1）；V為測定時反應體系總體積（mL）；D為稀釋倍數；W為天麻樣品質量（g）。

2 結果與分析

2.1 天麻多糖的最佳水提取條件

從表1中的R值（A>C>B）可看出，浸提溫度對得率的影響最大，其次是浸提時間，料水比的影響最小。通過正交試驗得出最優水平組合為A2B2C3，即天麻多糖的最佳水提條件為浸提溫度80 ℃，浸提時間3 h，料水比1∶30，提取天麻多糖得率最高。

2.2 標準曲線方程

以葡萄糖濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，進行一元線性回歸，得回歸方程A = 0.032 45C + 0.028 81，線性相關系數r = 0.999 5。結果表明，葡萄糖質量濃度在2.4 ～14.4 mg·L-1時，濃度與吸光度值線性關系良好，該方程可用于天麻多糖的含量測定。

2.3 穩定性試驗

精確量取烏天麻多糖供試樣品溶液0.5 mL，以“1.3.3節”試驗條件操作，每隔30 min測1次吸光度值，結果RSD = 1.78%（n=5），表明溶液顯色后在2.5 h內穩定。

2.4 精密度試驗

取試驗制備烏天麻多糖供試樣品溶液0.5 mL，在標準曲線制作試驗方法下連續測定5次，測得供試樣品吸光度值的RSD = 1.04%（n=5），表明精密度良好。

2.5 重復性試驗

稱取5 份同批烏天麻粉末0.1 g，按最佳水提條件提取多糖，并將其溶解定容至100 mL。平行量取5份多糖溶液0.5 mL，按前測試方法分別測定吸光度值，結果RSD = 2.01%（n=5），表明該試驗方法重現性良好。

2.6 加標回收率試驗

取5 份供試烏天麻多糖溶液0.5 mL，分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL葡萄糖對照品溶液，補充去離子水至2.0 mL，按“1.3.3”試驗條件操作測試，計算回收率（表2），得平均回收率為97.73%，RSD為2.06%。結果表明，該試驗方法回收率較高，能夠準確測定天麻多糖含量。

2.7 天麻多糖含量

分別取試驗制備的烏天麻、黃天麻、綠天麻、紅天麻的多糖供試樣品溶液，加入蒽酮試劑顯色反應后測定吸光度值，并計算樣品中天麻多糖含量。表3表明，同一產地，不同天麻變型多糖含量不同。昭通產的4種天麻變型中，紅天麻的多糖含量遠高于烏天麻、黃天麻和綠天麻的多糖含量。同一天麻變型，不同產地的天麻多糖含量亦不同。云南昭通的紅天麻多糖含量顯著高于陜西寧強與湖北宜昌所產的紅天麻。試驗說明，天麻中多糖含量與天麻類型及產地因素有關。

3 結論與討論

（1） 天麻多糖提取的方法各不相同，本試驗在確定影響天麻多糖提取的單因素：溫度、料水比、時間的基礎上，通過正交試驗得出最優水平組合為A2B2C3。多糖含量測定采用蒽酮-硫酸法，顯色穩定，靈敏度高，重現性強，操作便捷，可以作為天麻多糖含量的測定方法。

（2） 通過多糖含量測試發現，同一天麻變型，昭通所產的紅天麻多糖含量最高，約是陜西寧強和湖北宜昌的5倍。綜合王韜等[11]對不同省份烏天麻多糖含量測定的數據，昭通烏天麻多糖平均含量為13.97%，貴州為9.18%，廣西為10.6%，河南為13.0%。這表明，昭通所產天麻的多糖含量普遍高于其他地區。由此，進一步說明了昭通之所以是全國天麻的主要產地，與其天麻多糖含量高有一定的內在關聯。

（3） 對云南昭通4種天麻變型的多糖含量測定發現，相同產地，不同變型多糖含量不同。紅天麻多糖含量顯著高于烏天麻、黃天麻和綠天麻。結合李德勛等[12]對昭通4種天麻變型天麻素含量測定結果，紅天麻中天麻素含量較高，為1.519%，僅低于綠天麻，而高于烏天麻和黃天麻。這表明，紅天麻含有較高的天麻素和天麻多糖，具有較高的內在品質，藥用價值高。

（4）紅天麻是馴化后的優良高產品種，生長快，適應廣，分生力強，但形態較烏天麻差。目前，此變型在我國栽培面積廣。烏天麻形態好，社會聲譽高，但生產周期長，分生力差，云南昭通是其主產地[13]。為了提高昭通天麻產量，加強天麻品質，應進一步研究天麻的有性繁殖，對紅天麻與烏天麻兩個優良品種進行雜交，以培育出具有較高藥效，又有優良外形的天麻品種。同時，從天麻多糖、天麻素等指標出發建立完善天麻質量評價體系，促進昭通天麻產業全面科學的發展。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2005年版一部） [M].北京：化學工業出版社，2005：44.

[2]楊世林，蘭進，徐錦堂.天麻的研究進展[J].中草藥， 2000，31（1）：66-69.

[3]范玉奇，李文蘭，王艷萍，等.天麻化學成分及藥理性質研究的進展[J].藥品評價，2005，2（4）：309-312.

[4]陳維紅，羅棟.天麻素、天麻多糖藥理作用研究進展[J].中國藥物評價，2013，30（3）：132-134， 141.

[5]劉現輝，郭曉娜，展俊平，等.天麻多糖對H22荷瘤小鼠細胞周期及caspase蛋白活性的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（20）：5681-5682.

[6]張曉靜，劉會東.植物多糖提取分離及藥理作用的研究進展[J].時珍國醫國藥，2003，14（8）：495-496， 497.

[7]任守利，劉塔斯，劉宇婧，等.天麻多糖提取工藝的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2010，30（1）：37-40.

[8]劉玉潭，梁華，蔡永萍，等.天麻多糖提取純化方法及性質的初步研究[J].激光生物學報，2007，16（4）：495-500.

[9]王宏軍，鄧旭明，蔣紅，等.蒽酮-硫酸比色法檢測多糖條件的優化[J].中國飼料，2011（4）：39-41.

[10]張紅，王騰，李翠清.響應面分析優化蒽酮-硫酸法測定桑葉中多糖的含量[J].食品工業科技，2012，33（24）：62-65.

[11]王韜，仇全雷，杜艷倉，等.云南昭通天麻多糖含量測定[J].西南林業大學學報，2011，31（1）：31-33.

[12]李德勛，陳桂，李輔碧，等.天麻不同變異類型藥材中天麻素含量比較[J].現代中藥研究與實踐，2007，21（3）：23-24.

[13]余昌俊，王紹柏，劉雪梅.天麻6個品種重要性狀比較分析[J].生物學通報，2010，45（3）：12-14.