血清miRNA檢測對直腸癌患者新輔助放化療效果的預測價值

鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫院，山東青島266042)

血清miRNA檢測對直腸癌患者新輔助放化療效果的預測價值

鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫院，山東青島266042)

目的 探討血清微小RNA(miRNA)has-let-7a、-7e及-7g檢測對直腸癌患者新輔助放化療效果的預測價值。方法 選擇中低位直腸癌患者43例，均采用奧沙利鉑聯合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療5周。治療后根據Mandard腫瘤消退分級標準分為消退良好組18例，無明顯消退組25例。治療前采用實時定量聚合酶鏈式反應技術檢測血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達；用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g對直腸癌放化療后腫瘤病理消退程度的預測價值，對比三者ROC曲線下面積(AUC)。結果 治療前消退良好組血清miRNA has-let-7e相對表達量低于無明顯消退組(P<0.05)；兩組血清hsa-let-7a和has-let-7e表達比較差異無統計學意義(P均>0.05)。miRNA has-let-7e預測新輔助放化療效果的AUC大于has-let-7a、has-let-7g的AUC(P均<0.05)。結論 血清miRNA has-let-7e可作為預測直腸癌新輔助放化療療效的血清標志物。

直腸腫瘤；微小RNA；新輔助化療；放射治療

結直腸癌是世界范圍內導致腫瘤相關死亡的重要原因之一，其中約30%為直腸癌[1]。多數直腸癌患者就診時已處于中晚期。近年來，新輔助放化療聯合手術治療已經成為中晚期直腸癌患者的標準治療手段。但由于患者個體差異較大，新輔助放化療療效也存在差異[2]。通過對放化療療效進行預測，對療效較差患者盡早給予手術治療，可避免無效治療[3]。目前臨床、代謝指標及影像學手段對療效的預測并不理想[4～6]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，能夠通過剪切或翻譯抑制對靶基因進行轉錄后水平的負調控[7,8]。目前探討miRNAs是否可作為直腸癌新輔助化療療效預測標志物的研究較少[9～11]。本研究對miRNA has-let-7a、-7e及-7g在直腸癌新輔助化療療效預測中的價值進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2013年3月本院收治的中低位直腸癌患者43例，均經腸鏡活檢確診，經盆腔CT或MRI檢查確定腫瘤分期，經輔助檢查排除肝或肺等遠端器官轉移，可耐受放化療。其中男32例、女11例，年齡32～78歲，TNM分期Ⅱ期4例、Ⅲ期39例，Karnofsky評分>60分?；颊呔炇鹬橥鈺?，并接受隨訪。本研究經醫院倫理協會批準。

1.2 治療方法 患者均接受奧沙利鉑聯合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療。放療方法：直線加速器X線照射靶區(直腸原發灶和淋巴引流區域)，用等中心三野照射法，后野∶左側野∶右側野=2∶1∶1，放射總劑量為50 Gy，2.0 Gy/次，1次/d，每周照射5 d?；煼椒ǎ簥W沙利鉑每次50 mg/m2，加入50 g/L葡萄糖注射液250 mL靜滴2 h，1次/周；卡培他濱每次800 mg/m2口服，2次/d，每周5 d。放化療同步進行，均連續治療5周。在新輔助放化療期間定期檢查患者血常規和肝腎功能，同時對患者進行積極對癥支持治療和營養治療。

1.3 療效評價標準 治療結束后用腫瘤病理消退程度來評價新輔助放化療治療效果。術后標本送病理科進行病理分析，采用Mandard腫瘤消退分級標準(TRG)對直腸癌病理消退情況進行評價，TRG1級：腫瘤完全消退，完全無殘留癌細胞；TRG2級：腫瘤消退良好，少量殘留癌細胞；TRG3級：腫瘤中度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，纖維化占26%～50%；TRG4級：腫瘤輕度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，但不超過腫瘤的25%；TRG5級：腫瘤無消退，腫瘤細胞無變化，無纖維組織。TRG1、2級視為腫瘤病理消退良好，TRG3、4、5級視為腫瘤無明顯消退[12]。

1.4 血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達檢測 采用實時定量聚合酶鏈式反應技術(qRT-PCR)。治療前采集患者清晨空腹靜脈血，置于含枸櫞酸鈉的抗凝管中，經低溫、超速和離心獲得血清，存放于-80 ℃冰箱備用。用miRNA提取試劑盒提取RNA，并檢測RNA質量(A260/A280 為1.8～2.1)。通過Taqman miRNA反轉錄試劑盒反轉錄RNA獲得cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書，以cDNA為反應模板，依次加入上下游引物、2×SYBR green PCR Master Mix以及無RNase雙蒸水，配置成反應體系。在ABI公司7300 PCR儀中進行反應，反應條件：預變性95 ℃ 10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共擴增40個循環，每個樣本重復2次。采用2-ΔΔct法計算miRNA相對表達量。

2 結果

2.1 不同消退程度患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g表達比較 43例患者經治療后TRG1級9例、2級9例、3級17例、4級6例、5級2例；消退良好組18例，無明顯消退組25例。患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對表達量比較見表1。

表1 兩組治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對表達量比較

注：與無明顯消退組比較，*P<0.05。

2.2 miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g對放化療療效的預測價值 繪制ROC曲線，見圖1。miRNA has-let-7e的AUC(0.760)大于miRNA has-let-7a(0.551)、miRNA has-let-7g(0.560)，比較差異有統計學意義(P均<0.05)，miRNA has-let-7a與miRNA has-let-7g的AUC比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

圖1 miRNA has-let-7a、-7e及-7g預測直腸癌

3 討論

新輔助治療可以視為腫瘤患者腫瘤細胞的減量治療，包括術前化療或者術前化療與放療相結合，其能夠減小患者的腫瘤負荷，提高腫瘤患者手術完全切除率。XELOX已經成為直腸癌化療一線治療方案的首選，是進展期直腸癌患者一種新的輔助治療手段。與術后放化療比較發現，新輔助放化療可以減少放化療毒副反應、改進直腸癌局部控制、增加保肛率并且延長患者的無進展生存時間。但由于患者個體差異較大，新輔助放化療的治療效果差異也比較大。個體的遺傳因素是導致個體治療敏感性的重要因素[13]。研究表明，導致腫瘤發生的分子基礎為腫瘤信號通路異常。通過檢測分析患者腫瘤信號通路基因的表達水平，可以獲得腫瘤放化療耐受或敏感的分子標志物，利用這些分子標志物可以預測新輔助放化療的治療敏感性，加強患者的個體化治療[14]。同時研究也表明，腫瘤患者血漿中游離的DNA、RNA及某些基因突變與腫瘤組織保持著高度的一致性，因此外周血腫瘤標志物的篩選是目前腫瘤領域的研究熱點之一。基于腫瘤分子標志物可以優化患者的個體治療，也是目前腫瘤治療的趨勢[15]。miRNA是高度保守的內源性非編碼單鏈RNA。miRNA非常穩定，在劇烈條件下，如高溫、驟冷、強酸、強堿等，都很難發生降解，同時期可以抵御由于RNA酶導致的降解。因此miRNA作為新的分子標志物將為腫瘤患者的早期診療提供全新的手段。

目前僅有少量研究探討循環miRNA在預測結直腸癌新輔助放化療療效的預測作用。miRNA has-let-7a、-7e、-7g可能為預測直腸癌新輔助放化療效果的因子[16,17]，但研究樣本量有限。在本研究中，我們納入43例直腸癌患者，檢測新輔助放化療前血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g，結果發現，miRNA has-let-7e表達水平與療效相關，miRNA has-let-7e高表達的直腸癌患者，新輔助放化療效果差；ROC曲線也顯示其對療效預測的準確度較高。未來需要更多前瞻性研究就miRNA has-let-7e對直腸癌新輔助放化療的預測作用進行驗證。

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袁海成(E-mail:yuanhaicheng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.030

R735.37

B

1002-266X(2017)05-0089-03

2016-11-14)