人非小細(xì)胞肺癌組織中miR-200b的表達(dá)變化及意義

羅衛(wèi)民，羅湘玉，郭家龍，林稱意，張軍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

人非小細(xì)胞肺癌組織中miR-200b的表達(dá)變化及意義

羅衛(wèi)民，羅湘玉，郭家龍，林稱意，張軍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

目的 觀察微小RNA-200b(miR-200b)在人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 采用原位雜交技術(shù)檢測88例NSCLC組織與癌旁正常肺組織中的miR-200b表達(dá)，分析miR-200b與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 NSCLC組織中miR-200b陽性表達(dá)率低于癌旁正常組織(P<0.05)。miR-200b表達(dá)與NSCLC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。隨訪截止2016年2月10日，miR-200b低表達(dá)NSCLC患者病死率高于高表達(dá)者，中位生存時間短于高表達(dá)者(P均<0.05)。結(jié)論 miR-200b在NSCLC組織中呈低表達(dá)，其可作為評估患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一。

非小細(xì)胞肺癌；微小RNA-200b；預(yù)后

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率約占肺癌的80%[1]。肺癌病死率高，在初次診斷后5年生存率低于15%，轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[2]。肺癌的發(fā)生涉及多因素、多分子[3]。研究NSCLC發(fā)生的分子機(jī)制，有助于NSCLC早期檢測標(biāo)志物和治療方法的確定。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小RNA分子，通過與靶mRNA3′非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后和(或)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[4]。研究顯示，miR-200b在胃癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并具有類似抑癌基因樣作用[5]；且有研究認(rèn)為，miR-200b可作為肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物[6]。本研究觀察miR-200b在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年9月～2014年8月本院收治的NSCLC患者88例，均經(jīng)病理檢查確診。其中男49例、女37例，年齡35～74歲；術(shù)前均未行放化療。術(shù)后留取腫瘤組織；另取48例癌旁正常組織(距腫瘤組織>5 cm)作對照。出院后對患者進(jìn)行電話隨訪，最長隨訪時間為64個月，隨訪截止2016年2月10日。

1.2 癌組織與癌旁正常組織中miR-200b表達(dá)檢測 采用原位雜交法。肺組織芯片脫蠟至水；3%胃蛋白酶消化15～20 min，水洗后4%甲醛固定；按miRNA探針說明書進(jìn)行操作，探針用無酶水稀釋，稀釋終比例為1∶600，先用預(yù)雜交液于55 ℃預(yù)雜交2 h后再用地高辛標(biāo)記的miR-200b探針(購自美國Exiqon公司)于55 ℃進(jìn)行雜交過夜；次日用不同濃度SSC緩沖液依次洗滌；室溫封閉30 min；生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h；鏡下進(jìn)行DAB顯色并控制顯色時間；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。結(jié)果判定：鏡下觀察呈棕黃色顆粒的陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)與胞核中為miR-200b表達(dá)陽性。對miR-200b信號強(qiáng)度進(jìn)行評分，無信號≤1分，弱陽性信號>1～2分，中等陽性信號>2～3分，強(qiáng)陽性信號>3～4分。在400倍顯微鏡下每個標(biāo)本選取3個視野，統(tǒng)計miR-200b陽性細(xì)胞所占百分比。信號強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比<2為miR-200b低表達(dá)，≥2為miR-200b高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 生存曲線分析患者預(yù)后。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織與癌旁正常組織中miR-200b表達(dá)比較 NSCLC組織中miR-200b陽性表達(dá)32例，陽性表達(dá)率為36.36%；癌旁正常組織中miR-200b陽性表達(dá)30例，陽性表達(dá)率為62.50%；二者陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-200b表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-200b表達(dá)與NSCLC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。而不同年齡、性別、組織學(xué)類型及吸煙患者間miR-200b表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

2.3 miR-200b表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪至2016年2月10日，NSCLC組織中miR-200b低表達(dá)56例，死亡34例，病死率60.71%；miR-200b高表達(dá)32例，死亡11例，病死率34.38%；二者病死率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-200b低表達(dá)者中位生存時間為(23.51±6.24)個月，miR-200b高表達(dá)者中位生存時間為(40.26±11.07)個月；二者中位生存時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 miR-200b表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

生物信息學(xué)和微陣列芯片研究顯示，miRNAs可直接調(diào)控人類1/3至半數(shù)的基因，且每個miRNA預(yù)測可靶向調(diào)控幾百個轉(zhuǎn)錄本，表明miRNAs可能是人類最大的基因調(diào)控者[7]。miRNAs參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、增殖、血管生成、新陳代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。越來越多的研究者對miRNAs在細(xì)胞系、組織以及血清樣本中進(jìn)行表達(dá)譜分析，以鑒定新的腫瘤標(biāo)志物，如血清miRNA-24、miRNA-320a、miRNA-423-5p可用于結(jié)腸癌的早期診斷[8]。miR-21與miR-210在乳腺癌中高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后相關(guān)[9]。在骨肉瘤中miRNA-217、miRNA-646低表達(dá)，且與患者的臨床分期、預(yù)后相關(guān)[10]。

自從第一次報道了miRNA在肺癌中的表達(dá)后[11]，隨后有大量涉及miRNA與肺癌的研究。miRNAs參與肺癌的多種生物學(xué)行為，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與凋亡[12]。研究已證實(shí)，在肺癌中miRNA表達(dá)譜、肺組織中的特異miRNA表達(dá)與疾病預(yù)后和臨床結(jié)局相關(guān)，miR-221、miR-222、miR-449a、miR-21、miR-205、miR-10b、miR-143、miR-181a在NSCLC組織中表達(dá)失調(diào)，是腫瘤發(fā)生的潛在重要因子[13]。Mavridis等[14]研究表明，miR-197在NSCLC中高表達(dá)與患者腫瘤大小、鱗癌組織學(xué)類型相關(guān)，并且miR-197高表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。miR-148b在NSCLC組織中低表達(dá)，其表達(dá)狀態(tài)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)miR-197在NSCLC組織中低表達(dá)可作為一個獨(dú)立預(yù)測生存指標(biāo)[15]。

研究顯示，miR-200b在多種腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，并與患者的疾病進(jìn)展和臨床預(yù)后相關(guān)。Tang等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-200b在胃癌組織中低表達(dá)，并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)。Cao等[17]顯示，miR-200b在卵巢癌中高表達(dá)與患者的臨床分期、組織分化程度及預(yù)后生存相關(guān)。miR-200b在乳腺組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)狀態(tài)與乳腺癌患者的TNM 分期和ER受體陰性、HER-2陽性表達(dá)相關(guān)，多變量分析發(fā)現(xiàn)miR-200b在乳腺癌中低表達(dá)可作為一個獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[18]。miR-200b在膠質(zhì)瘤組組中低表達(dá)，其低表達(dá)與Ⅲ～Ⅳ期患者的無病生存期和總生存期相關(guān)，且miR-200b可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[19]。

本研究采用原位雜交技術(shù)在88例NSCLC組織與癌旁正常組織中檢測miR-200b的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-200b在NSCLC組織中的表達(dá)相比癌旁正常肺組織明顯下調(diào)。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-200b表達(dá)水平與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線統(tǒng)計分析顯示， miR-200b低表達(dá)者病死率高于miR-200b高表達(dá)者，中位生存時間短于高表達(dá)者。提示miR-200b表達(dá)越低，NSCLC患者預(yù)后越差，表明miR-200b表達(dá)高低與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。由此可見，在NSCLC患者中miR-200b低表達(dá)可能是NSCLC發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)指標(biāo)之一。因此，檢測miR-200b在NSCLC組織中的表達(dá)差異，可作為判斷NSCLC患者病情進(jìn)展和預(yù)后的參考依據(jù)。

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B

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2016-07-19)