多被銀蓮花總皂甙對ACC-M細胞內Bcl-2與Bax蛋白表達的影響

晏震，陳彥平，劉現云

(1河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院，河北邢臺054001；2河北醫科大學第四醫院；3邢臺醫學高等專科學校)

多被銀蓮花總皂甙對ACC-M細胞內Bcl-2與Bax蛋白表達的影響

晏震1，陳彥平2，劉現云3

(1河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院，河北邢臺054001；2河北醫科大學第四醫院；3邢臺醫學高等專科學校)

目的 探討多被銀蓮花總皂甙對人涎腺腺樣囊性癌高肺轉移細胞(ACC-M)內Bcl-2和Bax蛋白表達的影響。方法 將體外培養的ACC-M細胞隨機分為實驗組與對照組，分別加入50 μg/mL多被銀蓮花總皂甙溶液2 mL、含同樣濃度二甲基亞砜的 RPMI1640培養液2 mL。分別于培養24、48、72 h用Western blotting法檢測細胞內Bcl-2和Bax蛋白的表達量。結果 對照組各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；實驗組各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；兩組間各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論 多被銀蓮花總皂甙可上調ACC-M細胞內Bax蛋白表達，同時下調Bcl-2蛋白表達，導致Bax/Bcl-2升高。

涎腺腺樣囊性癌；高肺轉移細胞；多被銀蓮花總皂甙；B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白

涎腺腺樣囊性癌(SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，該腫瘤易發生遠處轉移且術后具有較高的局部復發率。目前尋找不良反應小、可長期應用的抗腫瘤藥物一直是口腔醫學研究的重要課題之一。多被銀蓮花是毛茛科銀蓮花屬植物的根莖，藥理活性研究發現多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮痛、抗氧化、抗驚厥及抑菌作用。目前研究表明,Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中發揮重要作用[1]。其中Bcl-2蛋白具有拮抗細胞凋亡作用稱為癌基因，而Bax蛋白具有促進細胞凋亡作用稱為抑癌基因。兩種蛋白正常情況下處于相對穩定狀態，但當細胞受到相關信號刺激時，兩種蛋白的平衡被打破，則導致細胞凋亡或促進腫瘤產生。多被銀蓮花總皂甙對SACC高肺轉移細胞(ACC-M)中Bcl-2和Bax蛋白表達有何影響，尚未見國內外文獻報告。本研究于2014年3月～2015年3月對其進行探討，為多被銀蓮花總皂甙治療SACC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ACC-M細胞，由北京口腔醫院提供。多被銀蓮花總皂甙，取多被銀蓮花(石家莊樂仁堂藥店)1 kg，粉碎后用95%乙醇室溫浸泡3次，每次用乙醇5 L，回收乙醇，得到浸膏426.4 g；將浸膏放入800 mL水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次500 mL；將下層水溶液放進圓底燒瓶，加入25 g固體KOH，80 ℃加熱水解2 h；用5%鹽酸調pH值至6。再用正丁醇萃取4次，每次500 mL，合并萃取液，減壓回收正丁醇，得總皂甙148.8 g，回收率為14.88%；用二甲基亞砜將多被銀蓮花總皂甙溶解配制成20 mg/mL的儲存液，于4 ℃恒溫冰箱儲存。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液將儲存液稀釋為1、25、50、75、100 μg/mL濃度的使用液。

1.2 ACC-M細胞培養及藥物濃度確定 將ACC-M細胞取出培養于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養基中，將培養瓶放入CO2培養箱中培養，當細胞爬滿瓶底壁的80%時即可進行傳代。用吸管將細胞吹打制成細胞懸液并計數，細胞以1.0×105/mL接種于新的培養瓶中。取對數生長期細胞，經消化液消化后制成4.0×106/mL的細胞懸液。接種于培養瓶中，每瓶2 mL，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中繼續培養。采用MTT比色試驗將對數生長期的ACC-M細胞移入96孔培養板中，培養24 h，分別加入濃度為1、25、50、75、100 μg/mL的多被銀蓮花總皂甙100 μL，并設置對照和調零孔，每組5個復孔。于培養24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的預制MTT溶液20 μL，繼續培養4 h棄上清液，再加入二甲基亞砜溶液200 μL避光振蕩搖勻，用酶標儀測492 nm波長各孔的吸光度值。依據吸光度值計算各組的生長抑制率并通過作圖法求出24、48、72 h的IC50值分別為 46.3、56.59、44.60 μg/mL，其最高抑制率可達90.3%，據此設定本實驗銀蓮花總皂甙濃度為50 μg/mL。

1.3 ACC-M細胞內Bcl-2與Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將貼壁后的細胞從培養箱中取出，棄培養液。隨機分為實驗組與對照組，每組設置3個復孔。實驗組加入50 μg/mL的多被銀蓮花總皂甙溶液2 mL，對照組加入含同樣濃度二甲基亞砜的 RPMI1640培養液2 mL。分別于培養24、48、72 h后提取各組細胞組織蛋白。參照試劑盒說明書進行操作。用Odyssey成像系統掃描各條帶灰度值，并進行半定量測定，將β-actin條帶作為內參照。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。計算Bax蛋白與Bcl-2蛋白相對表達量的比值(Bax/Bcl-2)。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

干預24、48、72 h，對照組各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；實驗組各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；兩組間各時間點Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同干預時間Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比較

3 討論

SACC發病率約占涎腺癌的20%左右，可發生于任何年齡，以腭腺最為常見，大涎腺發病低但好發于頜下腺、舌下腺，無包膜，具有沿神經血管侵襲及肺轉移的生物學特點。俞光巖等[2]分析顯示，SACC淋巴結轉移率僅2.1%、而遠處轉移率高達28.8%。目前治療方式主要為手術切除，輔以化療、放療、生物治療及中醫中藥治療等。由于其易侵襲，與周圍組織界限不清，手術中完整切除難度大，短期治療效果較好，遠期容易發生遠處轉移。據文獻報道其遠期生存率為37.4%～41.8%[3]。致死的主要原因多為遠處轉移，其中肺部轉移占比最高。目前的化療藥物不良反應較大且臨床療效不甚理想。本研究的目的是為臨床尋找有效、不良反應小、可長期應用的抗腫瘤藥物。

研究證實，腫瘤的發生與癌基因的高表達及抑癌基因的低表達密切相關[4,5]。Bcl-2家族蛋白可以通過改變線粒體膜的通透性導致細胞凋亡，其機制為Bcl-2相關蛋白形成離子轉運通道，引起線粒體膜的通透性改變，達到誘導細胞凋亡的目的。而Bcl-2家族兩種蛋白的構成比例是細胞凋亡信號轉導通路中引起細胞凋亡的關鍵因素，其中Bax/Bcl-2是啟動凋亡過程的關鍵。Korsmeye等[6]提出Bcl-2/Bax是調控細胞凋亡的可變電阻器，在各種因素刺激下，細胞的生死直接取決于Bcl-2和Bax兩種因子平衡的結果。王晶等[7]發現，美洲大蠊提取物可使Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達增強，Bcl-2蛋白表達減弱，從而降低線粒體膜電位抑制人肝癌細胞Bel-7402增殖。目前研究認為，當Bcl-2和Bax通過形成二聚體來調控細胞凋亡過程，二者形成異源二聚體時則能夠抑制細胞凋亡。Mackey等[8]分析了前列腺癌腫瘤組織中Bcl-2、Bax表達水平及Bcl-2/Bax與放療療效的關系，結果顯示Bcl-2/Bax升高是導致前列腺癌放療失敗的獨立危險預后因素。李永生等[9]研究發現，粉防己堿抑制人膀胱癌BIU-87的生長與下調Bcl-2、Survivin和上調Bax、Capseae-3表達有關。目前研究發現，多數抗腫瘤藥物通過誘導細胞凋亡達到治療目的，這兩種基因與腫瘤藥物治療的關系已成為抗腫瘤藥物研究的熱點之一[10]。

中藥多被銀蓮花為毛莨科銀蓮花屬植物，其干燥根莖又稱為兩頭尖，藥性辛、熱、有毒，歸脾經，具有消癰腫、祛風濕的功效，臨床上常用來治療四肢拘攣、癰腫潰爛、風寒濕痹、骨節疼痛等。研究發現，多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮痛、抗氧化、抗驚厥、抑菌及抗遲發型超敏反應等作用[11～13]。張爾賢等[14]從中藥多被銀蓮花中提取總皂苷(其中多被銀蓮花素A占20%)，測試總皂甙對小鼠肝癌H22、肉瘤S180和艾氏腹水癌EAC的抑瘤率以及體外對4種人癌細胞的抑制率，結果表明多被銀蓮花總皂甙具有明顯的抑瘤作用。前期實驗中ACC-M細胞經濃度為0、25、50、75 μg/mL多被銀蓮花總皂甙溶液干預72 h后，其凋亡率分別為21.11%、27.18%、30.6%、34.0%,表明多被銀蓮花總皂甙具有明顯抑制ACC-M細胞增殖并誘導其凋亡的作用，但具體作用機制尚不明確。

本研究結果顯示，在50 μg/mL多被銀蓮花總皂甙藥物作用下,ACC-M細胞內Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低；且時間越長，以上變化越明顯，Bax/Bcl-2逐漸增大。由此看來，多被銀蓮花總皂甙可下調ACC-M細胞Bcl-2基因的表達以及上調Bax基因表達，使得Bax/Bcl-2增大，從而誘導ACC-M細胞發生凋亡。對急性髓系白血病患者的Bax、Bcl-2表達水平與患者疾病緩解率、無病生存率關系的研究發現，Bax/Bcl-2對精確預測臨床療效有重要意義[15]。劉紅等[16,17]分別在卵巢癌、宮頸癌的臨床研究中得到類似結論。因此我們認為，多被銀蓮花總皂甙能夠使ACC-M細胞內Bax/Bcl-2增大從而抑制ACC-M細胞活性并促進其凋亡。

綜上所述，多被銀蓮花總皂甙可以誘導ACC-M細胞凋亡，其機制可能為上調促凋亡基因Bax的表達及下調抑凋亡基因Bcl-2的表達，使Bax/Bcl-2增加，導致線粒體外膜的通透性改變，進而引起ACC-M細胞凋亡。

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陳彥平(E-mail：cyp1962@126.com)

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R739.85

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1002-266X(2017)05-0033-03

2016-09-21)