牡荊苷對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織能量代謝的影響

顏娟，鄭茂東，崔玉環，趙秀花，班旭霞，趙虹琇

(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

·基礎研究·

牡荊苷對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織能量代謝的影響

顏娟，鄭茂東，崔玉環，趙秀花，班旭霞，趙虹琇

(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

目的 探討牡荊苷對小鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織能量代謝的影響。方法 將雄性昆明種小鼠60只隨機均分為6組：假手術組、模型組、(10、20、40 mg/kg)牡荊苷組、尼莫地平組。采用線栓法制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型。模型制備24 h，處死小鼠，取腦組織。用HPLC法檢測腦組織三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)，計算能荷(EC)值；用相應試劑盒檢測乳酸(LD)、乙酰膽堿酯酶(TchE)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶活力。結果 與模型組比較，尼莫地平組及10、20、40 mg/kg牡荊苷組ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)，TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P<0.05)；10、20 mg/kg牡荊苷組以上指標與40 mg/kg牡荊苷組、尼莫地平組比較，P均<0.05，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較，P均>0.05；牡荊苷三個劑量組之間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。結論 牡荊苷能改善腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織的能量代謝，且該作用呈劑量依賴性。

腦缺血；再灌注損傷；牡荊苷；能量代謝；小鼠

腦缺血是臨床常見的腦血管疾病之一，尤其腦缺血再灌注損傷是目前研究的熱點。腦組織中血流中斷以及再灌注引起腦組織細胞發生快速的級聯反應，該反應由眾多環節組成，如腦能量代謝障礙[1]、細胞內鈣失穩態[2]、興奮性氨基酸毒性[3]、細胞酸中毒[4]、炎癥細胞因子損害[5]、自由基損傷[6]及凋亡基因激活[7]等。腦是能量代謝最活躍的器官，當腦血流供應中斷，引起腦細胞損傷，其中腦神經最易受損，其功能與能量代謝密切相關。三磷酸腺苷(ATP)作為腦能量的主要來源，對維持細胞正常生理功能起重要作用。金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有消腫明目、清熱解毒的功效。牡荊苷是金蓮花主要藥效成分，屬黃酮碳苷類化合物，具有抗氧化[8]、抗炎、抗病毒、抗癌、降壓等作用。研究表明，牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織細胞膜的轉運能力有保護作用[9]。2016年3～6月,本研究通過線拴法制備腦缺血再灌注小鼠模型，探討牡荊苷對其腦組織能量代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及藥品、試劑 昆明種雄性小鼠60只，體質量22～24 g，2月齡，由河北北方學院實驗動物中心提供，合格證號：XCYK(冀)2010-2014。環境室溫20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水。牡荊苷(河北北方學院藥物研究所)，純度>98%；尼莫地平注射劑(河北醫科大學制藥廠)；乳酸(LD)測試盒、乙酰膽堿酯酶(TchE)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所提供)；ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)標準對照品(天津一方有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動物分組及腦缺血再灌注模型制備 將小鼠隨機分為假手術組、模型組、(10、20、40 mg/kg)牡荊苷組、尼莫地平組，每組10只。按文獻[10]采用線拴法制備小鼠腦缺血再灌注模型，于術后48 h阻斷兩側頸總動脈造成大腦缺血狀態，5 min后恢復血液再灌注。假手術組術中僅暴露頸總動脈，并不進行插線。模型制備前牡荊苷組腹腔注射不同濃度(10、20、40 mg/kg)牡荊苷、尼莫地平組腹腔注射(0.6 mg/kg)尼莫地平，均連續3 d。模型制備再灌注24 h，小鼠稱重，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，斷頭取腦，去除小腦和腦干。取腦缺血側2/3腦組織，去除樣本表面附屬物，用5%高氯酸制成10%腦勻漿，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.3 腦組織ATP、ADP、AMP及TchE、LDH、LD、ATP酶活力檢測 取腦組織上清液，加入碳酸鉀溶液0.12 mL，調pH值為中性，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，取上清液，HPLC法檢測ATP、ADP、AMP[11]，計算能荷(EC)值。EC值=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。取腦組織上清液，采用試劑盒檢測LD、TchE、LDH、ATP酶(Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP)活力。

2 結果

2.1 各組腦組織能量代謝指標比較 與假手術組比較，模型組腦組織ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組及10、20、40 mg/kg牡荊苷組ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)；與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組腦組織ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比差異無統計學意義(P均>0.05)；牡荊苷組三個劑量組之間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腦組織能量代謝指標比較

注：與假手術組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與尼莫地平組比較,cP<0.05；與10 mg/kg牡荊苷組比較，dP<0.05；與20 mg/kg牡荊苷組比較，eP<0.05。

2.2 各組腦組織TchE、LDH、LD及ATP酶活力比較 與假手術組相比，模型組腦組織TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P<0.05)；與模型組比較，10、20、40 mg/kg牡荊苷組TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P均<0.05)。與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P均<0.05)，40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比差異無統計學意義(P均>0.05)；牡荊苷三個劑量組之間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

3 討論

表2 各組腦組織TchE、LDH、LD及ATP酶活力比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與尼莫地平組比較，cP<0.05；與10 mg/kg牡荊苷組比較，dP<0.05；與20 mg/kg牡荊苷組比較，eP<0.05。

腦缺血后腦組織局部血流不足，導致大腦能量供不應求，臨床主要表現為短暫性或者持久性神經功能損傷癥狀，對人體有很大的危害。研究表明，當腦組織血流完全阻斷時，瞬間影響腦組織神經元代謝，接著腦電活動停止，進而破壞腦組織能量代謝及離子平衡，ATP大量耗竭。由于腦組織本身沒有儲備葡萄糖和氧氣的能力，在腦損傷后糖酵解增強易產生酸中毒，引起腦組織水腫、細胞壞死。乳酸是糖酵解終產物，其濃度與缺氧程度呈正相關，與腦細胞內pH值相關，乳酸含量升高，引起pH值下降，導致腦膠質細胞不可逆損害，進而腦細胞膜上離子泵功能出現障礙，大量K+外流，大量Na+、Cl-和水內流進入腦細胞內，則腦神經元發生不可逆的損害[11]。腦能量代謝障礙直接反映腦神經功能缺陷，在腦缺血模型中腦部缺血嚴重導致LD增加，LDH以及TchE活力下降，細胞膜上ATP酶活性降低，ATP耗竭，腦細胞能量代謝嚴重受損，最終損害腦功能[12]。馬霄等[13]研究表明，半枝蓮總黃酮中劑量組可顯著提高反復腦缺血再灌注小鼠腦TchE活力和LDH活力，明顯降低小鼠腦LD水平。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組腦組織TchE、LDH活力降低，LD活力增加；牡荊苷組可顯著增加腦組織中TchE、LDH活力，降低LD活力。10、20 mg/kg牡荊苷組對TchE、LDH、LD作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無差異。

Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP是存在于生物膜上的一種蛋白酶，其生物學功能物包括能量轉化、物質轉運及信息轉運，維持胞內外離子平衡，也是評價細胞膜功能的指標[14]。腦缺血再灌注損傷時，細胞氧化磷酸化能力減弱，ATP合成減少，能量消耗增多，Na+-K+泵功能受阻，Na+-K+-ATP酶活性降低，細胞膜對 Na+和K+的轉運出現障礙。Na+和K+跨膜轉運不足，激活電壓依賴性鈣通道(VDC)，引起大量Ca2+內流，同時腦損傷后可引興奮性氨基酸囊泡大量破裂，釋放神經遞質，激活突觸后膜的N-甲基-D-天冬氨酸受體，使VDC開放，引起大量Ca2+內流。Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細胞內Ca2+穩態過程中起重要作用。腦損傷時Ca2+-Mg2+-ATP酶活性也下降，Ca2+不能泵入內質網則在神經細胞內形成“鈣超載”，誘發一系列病理損傷反應，加劇繼發性腦損傷。另外膜去極化引起的過多Na+和Ca2+內流也是腦細胞水腫產生的主要原因，能量代謝不足和ATP酶功能障礙是腦損傷引起的細胞損傷的重要因素[15，16]。黎曉等[17]研究發現，染料木素磺酸鈉能增加腦缺血再灌注損傷后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP活性，改善缺血區能量代謝，減輕腦水腫及“鈣超載”。本實驗結果顯示，與假手術組比，模型組腦組織Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低顯著；牡荊苷組可增加腦組織中Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力。10、20 mg/kg牡荊苷組對ATP酶活力作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無統計學差異。

腦組織內能量在維持細胞內外離子平衡、物質運輸、細胞膜完整性、信息傳遞、遞質釋放、合成代謝、攝取等方面起很大作用。當腦內血流供應受阻、能量耗竭時，運送到腦組織內葡萄糖和氧將減少，導致有氧氧化無法順利進行，生成的ATP減少；而且腦組織中以糖原形式存在的能量很少，進一步引起ATP含量下降，與此同時ATP分解產物AMP、ADP增加后又相繼分解，最終導致EC值明顯下降。EC值反映高能磷酸鍵在ATP、AMP、ADP之間的相互轉化，EC值可動態反映細胞能量平衡狀態[18]。黃小平等[19]研究發現，黃芪甲苷和三七的主要有效成分配伍可顯著增加腦缺血再灌注小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 的量和EC值。本實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組腦組織ATP、ADP、AMP量以及EC值降低；牡荊苷組顯著增加小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP量以及EC值。10、20 mg/kg牡荊苷組對ATP、ADP、AMP水平及EC值的影響作用低于尼莫地平組；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組相比無統計學差異。因此，牡荊苷對小鼠腦缺血再灌注引起的腦損傷具有保護作用，該作用可能與改善細胞能量代謝有關。

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河北省醫學科學研究重點課題(20150474)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.008

R743.31

A

1002-266X(2017)05-0026-04

2016-10-12)