miR-497-5p對人宮頸癌細胞增殖的抑制作用及機制

張君，高蘭陽，詹平，毛熙光

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

miR-497-5p對人宮頸癌細胞增殖的抑制作用及機制

張君，高蘭陽，詹平，毛熙光

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的 探討miR-497-5p對人宮頸癌細胞(HeLa)增殖的抑制作用及機制。方法 將對數生長期人宮頸癌HeLa細胞隨機分為兩部分，第一部分細胞隨機分為四組：miR-497-5p mimics NC+IKCa1 3′端非翻譯區(3′-URT)野生型雙熒光素酶重組質粒載體(IKCa1-wt)轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉染組、miR-497-5p mimics NC+3′-URT突變型雙熒光素酶重組質粒載體(IKCa1-mut)轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉染組，分別轉染相應質粒48 h，用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測HeLa細胞熒光素酶活性。第二部分細胞隨機分為三組：miR-497-5p mimics轉染組、miR-497-5p mimics NC轉染組和空白對照組，分別轉染相應質粒，用qRT-PCR技術檢測細胞IKCa1 mRNA表達，Western boltting法檢測細胞IKCa1蛋白表達，CCK-8法檢測細胞增殖能力。結果 第一部分細胞中的miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉染組熒光素酶活性較其他三組降低(P均<0.05)，其他三組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)，證實miR-497-5p與IKCa1 3′-URT存在特異性結合位點。第二部分細胞中的miR-497-5p mimics轉染組IKCa1 mRNA、蛋白的相對表達量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。第二部分細胞培養24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics轉染組增殖能力均較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 miR-497-5p可以通過負向調控IKCa1基因表達以抑制宮頸癌細胞增殖。

子宮頸癌；微小RNA-497-5p；中電導鈣激活性鉀離子通道；IKCa1基因；HeLa細胞；細胞增殖

中電導鈣激活性鉀離子通道(IKCa1)在人體廣泛分布，通過影響細胞內鈣離子濃度和細胞膜電位，調節細胞生理、病理活動。目前證實IKCa1基因在乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、肝細胞癌等惡性腫瘤組織中高表達[1～4]，參與腫瘤細胞的增殖、轉移和腫瘤血管形成[5]。前期研究[6,7]也發現，IKCa1基因在宮頸癌組織呈高表達，但其高表達的機制尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA，在轉錄后水平調節靶基因的表達，從而影響細胞的生物學行為[8]，在調節惡性腫瘤基因表達中發揮重要作用。為了解IKCa1在宮頸癌中高表達的機制，2016年4～10月，本研究采用雙熒光素酶報告基因檢測系統、qRT-PCR技術、Western blotting技術鑒定IKCa1是否為miR-497-5P的靶基因，初步探討miR-497-5p是否能通過靶向調控IKCa1基因影響HeLa細胞增殖。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人宮頸癌HeLa細胞株由西南醫科大學中心實驗室提供；胎牛血清購自杭州四季清；RPMI1640細胞培養液購自美國Gibco；Lipofectamin2000轉染試劑購自美國Invitrogen；IKCa1 3′端非翻譯區(3′-URT)的野生型和突變型雙熒光素酶重組質粒載體(IKCa1-wt、IKCa1-mut)、miR-497-5p模擬物(miR-497-5p mimics)、miR-497-5p 模擬物陰性對照(miR-497-5p mimics NC)，均由上海吉瑪制藥構建合成；雙Luciferase報告基因檢測系統試劑盒購于Promega；總RNA提取試劑盒購于北京天根；Rever Tre Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green RT-PCR Master Mix購于TOYOBO；PCR引物由上海生工合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物；IKCa1、β-actin抗體及二抗購于英國Abcam；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所。采用Targetscan、starBase、miRanda、miRDB在線搜索可能與IKCa1 3′-URT結合的miRNA，發現IKCa1 3′-URT與miR-497-5p存在互補配對序列，提示IKCa1可能為miR-497-5p的靶基因。

1.2 HeLa細胞分組及轉染 將對數生長期的HeLa細胞隨機分為兩部分。第一部分HeLa細胞按1×105/孔接種于24孔培養板中培養，隨機分為四組，miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉染組、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉染組。第二部分HeLa細胞按照3×105/孔接種于6孔培養板中培養，隨機分為三組：miR-497-5p mimics轉染組、miR-497-5p mimics NC轉染組和空白對照組。將各培養板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱培養24 h。按照轉染試劑說明書，配制轉染混合液，利用Lipofectamin2000，每孔轉染適量相應的雙熒光素酶報告載體和(或)miRNA。轉染6 h后，棄轉染液，加入適量新鮮不含抗生素的培養基，繼續培養，用于后續實驗。

1.3 HeLa細胞內雙熒光素酶活性檢測 采用雙熒光素酶報告基因檢測系統。第一部分HeLa細胞轉染48 h后，去除培養基，PBS洗滌3次，1×PLB裂解液按照100 μL/孔加入24孔培養板中，室溫輕緩晃動培養板15 min。每孔取裂解產物20 μL置于檢測板中，按照30 μL/孔加入LARⅡ試劑，于多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶活性。取出檢測板，每孔加入Stop & Glo Reagent試劑30 μL，于多功能酶標儀上檢測海腎熒光素酶活性。實驗獨立重復3次，記錄相關數據。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.4 HeLa細胞內IKCa1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR技術。第二部分HeLa細胞轉染48 h，按照RNA提取試劑盒步驟提取細胞總RNA，NanoDrop ND-1000測定及變性瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA質量。質量合格的RNA逆轉錄合成cDNA于-20 ℃保存備用，逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min。按照熒光定量試劑說明加入相應組分，反應體系20 μL。IKCa1上、下游引物：5′-GCAGGAACTGGCATTGGACT-3′、5′-CTGATCGTGCATTTAACCAGGA3′，GAPDH上、下游引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3′、5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s 40個循環，95 ℃ 10 s，72 ℃ 5 s，95 ℃ 10 s。實驗獨立重復3次，采用2-ΔΔCt法計算IKCa1 mRNA相對表達量。

1.5 HeLa細胞內IKCa1蛋白表達檢測 采用Wertern boltting法。第二部分HeLa細胞轉染72 h后提取細胞總蛋白。將總蛋白分為兩部分，一部分進行蛋白濃度測定，一部分加入適量5×Loding buffer混勻，沸水浴5 min后-80 ℃保存備用。取等量細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，TBST洗膜1次。5%脫脂奶粉封閉，搖床搖晃2 h后，TBST洗膜3次，加入封閉液稀釋好的一抗(IKCa1 1∶200，β-actin 1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過夜。室溫搖床使之恢復室溫，TBST洗膜3次，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光后凝膠成像系統成像，保存圖片。重復實驗3次。采用Quntity One軟件測得灰度值，以目的蛋白灰度值/內參灰度值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 HeLa細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。第二部分HeLa細胞轉染48 h，經胰酶消化，收集細胞，將其按照6×103/孔接種于96孔培養板中，設置調零孔，每組5個復孔，置于恒溫箱中培養。分別培養24、48、72、96 h，更換培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光培養2 h，用酶標儀于450 nm波長測吸光度值(OD值)，OD值與細胞數呈正比，以此評估細胞增殖能力。重復實驗3次，取平均值。

2 結果

2.1 miR-497-5p與IKCa1 3′-URT相互作用對熒光素酶活性的影響 miR-497-5p mimics NC+IKCa1-wt轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉染組、miR-497-5p mimics NC+IKCa1-mut轉染組、miR-497-5p mimics+IKCa1-mut轉染組熒光素酶活性分別為0.015 2±0.000 3、0.007 1±0.000 1、0.015 1±0.000 4、0.015 0±0.000 4。miR-497-5p mimics+IKCa1-wt轉染組熒光素酶活性較其他三組降低(P均<0.05)，其他三組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。證實miR-497-5p與IKCa1 3′-URT存在特異性結合位點。

2.2 miR-497-5p 對HeLa細胞內IKCa1 mRNA表達的影響 空白對照組、miR-497-5p mimics NC轉染組、miR-497-5p mimics轉染組IKCa1 mRNA的相對表達量分別為1.000±0.000、1.135±0.153、0.395±0.070。miR-497-5p mimics轉染組IKCa1 mRNA相對表達量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.3 miR-497-5p 對HeLa細胞內IKCa1蛋白表達的影響 空白對照組、miR-497-5p mimics NC轉染組、miR-497-5p mimics轉染組IKCa1蛋白的相對表達量分別為0.869±0.019、0.939±0.044、0.425±0.021。miR-497-5p mimics轉染組IKCa1蛋白相對表達量較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.4 miR-497-5p 對HeLa細胞增殖能力的影響 培養24、48、72、96 h，miR-497-5p mimics轉染組OD值均較其他兩組降低(P均<0.05)，其他兩組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組不同培養時間細胞增殖能力比較

3 討論

IKCa1是鈣激活鉀離子通道家族中的重要成員之一，由定位于19號染色體q13.2區的IKCa1基因編碼，在調節細胞生理功能和細胞分子信號轉導通路中發揮重要作用。近年來大量研究證實，IKCa1參與多種惡性腫瘤發生發展過程。Haren等[1]發現，IKCa1在乳癌組織和乳腺癌細胞中表達上調，與乳腺癌分期、分化程度及轉移密切相關。Lallet-Daher等[3]在研究中發現，前列腺癌組織中IKCa1基因呈高表達，IKCa1特異性阻斷劑TRAM-34阻斷IKCa1通道后，p21表達水平升高，從而抑制前列腺癌細胞增殖。Wang等[2]通過小鼠在體試驗證實，阻斷IKCa1通道能抑制子宮內膜癌的生長。Zhang等[9]利用shRNA技術沉默IKCa1基因和TRAM-34阻斷IKCa1通道后，細胞周期素D1、細胞周期素E、存活素表達降低，子宮內膜癌細胞周期阻滯在G0～1期；同時發現基質金屬蛋白酶2的表達水平下降，從而抑制子宮內膜癌細胞遷移和侵襲。我們前期研究中也證實IKCa1在宮頸癌中高表達[6，7]，克霉唑阻斷IKCa1通道后，IKCa1 mRNA表達下調，并抑制HeLa細胞增殖[10]，提示IKCa1基因參與了宮頸癌的發生發展，然而IKCa1高表達的機制尚不明確。

近年研究發現，miRNA調控人類1/3以上的基因，超過一半的miRNA基因位于腫瘤相關的染色體或其脆性位點上，與腫瘤的發生發展相關[11]，發揮著癌基因或抑癌基因的作用。目前已證實，宮頸癌及其癌前病變與高危型人類乳頭瘤病毒(HPV)持續感染密切相關。有研究[12]顯示，miR-497-5p在宮頸癌組織中呈現低表達，與高危型HPV感染密切相關。因此，對miR-497-5p與IKCa1基因是否存在靶向關系的探討，可能有利于了解IKCa1基因在宮頸癌發生發展中的意義及作用機制。

目前鑒定miRNA靶基因的方法主要有兩類：一類是生物信息學方法，操作簡單方便，但仍存在假陽性的可能；一類是生物學實驗方法，包括雙熒光素酶報告基因、RNA檢測和Wertern boltting技術，準確率高。本研究采取生物學實驗來鑒定IKCa1是否為miR-497-5P的靶基因。miRNA mimics是用化學合成方法合成的，通過模擬生物體內源的miRNA，增強內源性miRNA的表達。本研究通過轉染miR-497-5p mimics來上調HeLa細胞中miR-497-5p表達水平。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3′-URT區的互補序列完全或不完全結合而發揮作用。利用雙熒光素酶報告基因系統來檢測miR-497-5p與IKCa1 mRNA 3′-URT 是否存在互補序列。熒光素酶活性檢測顯示共轉染miR-497-5p mimics和IKCa1-wt后，HeLa細胞熒光素酶活性降低，初步證實IKCa1為miR-497-5p的靶基因之一，為miR-497-5p靶向調控IKCa1基因提供了結構學依據。miRNA調控基因表達的主要方式是以完全互補或不完全互補結合目的基因mRNA 3′-URT，導致mRNA降解，從而抑制蛋白質合成。因此我們采用qRT-PCR、Wertern boltting法檢測各組IKCa1 mRNA及蛋白表達，發現轉染了miR-497-5p mimics的HeLa細胞中IKCa1 mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組降低，提示miR-497-5p可負向調控IKCa1的表達，從而為miR-497-5p靶向調控IKCa1基因提供了功能學依據。

本研究通過CCK-8法檢測發現，轉染了miR-497-5p mimics的HeLa細胞增殖活性降低，提示miR-497-5p可抑制HeLa細胞增殖活性，可能與miR-497-5p負向調控IKCa1基因有關。同時，與我們前期研究中發現阻斷IKCa1通道能抑制HeLa細胞增殖的結論相符。

綜上所述，miR-497-5p可以抑制HeLa細胞增殖，這可能是通過下調IKCa1表達實現的。

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Inhibitory effect of miR-497-5p on proliferation of human cervical carcinoma cell

ZHANGJun,GAOLanyang,ZHANPing,MAOXiguang

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of miR-497-5p on proliferation of human cervical cancer HeLa cells. Methods The human cervical cancer HeLa cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into two parts. The first part was randomly divided into 4 groups: miR-497-5p mimics NC and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group, miR-497-5p mimics NC and IKCa1-mut co-transfection group and miR-497-5p mimics and IKCa1-mut co-transfection group which were transfected by corresponding plasmids for 48 h. The luciferase activity of HeLa cells was detected by double luciferase reporter assay system. The second part was randomly divided into 3 groups: miR-497-5p mimics transfection group, miR-497-5p mimics NC transfection group and blank control group. Cells in each group were transfected with Lipofectamin 2000. The expression of IKCa1 mRNA was detected by qRT-PCR, IKCa1 protein expression was detected by Western blotting and the proliferation ability of HeLa cells was measured by CCK-8 assay. Results The luciferase activity of miR-497-5p mimics and IKCa1-wt co-transfection group was lower than that of the other three groups of the first part (allP<0.05), and no significant difference among other three groups ( allP>0.05), which confirmed that miR-497-5p and IKCa1 3 '-URT had specific binding sites. The expression of IKCa1 mRNA and protein of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups of the second part (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). The proliferation ability of the miR-497-5p mimics transfection group was lower than that of the other two groups at 24, 48, 72 and 96 h of culture (allP<0.05), and there was no significant difference between the other two groups (allP>0.05). Conclusion miR-497-5p can inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells by negatively regulating the expression of IKCa1 gene.

cevical carcinoma; micro RNA-497-5p; intermediate-conductance-Ca2+-activated K+channel; IKCa1 gene; HeLa cells; cell proliferation

四川省衛生廳科研基金資助項目(110373)；四川省瀘州市科技局科研項目(2013LZLY-J30)。

張君(1988-)，女，碩士在讀，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail：446358256@qq.com

毛熙光(1965-)，男，碩士，教授，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail：mxg6639@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.005

R737.33

A

1002-266X(2017)05-0015-04

2016-11-10)