熒光定量PCR檢測原料乳中魯氏不動桿菌方法的建立

張慧敏,夏海磊,王夢琦,邢世宇,毛永江,岑 寧,楊章平

(揚州大學動物科學與技術學院,江蘇揚州 225009)

熒光定量PCR檢測原料乳中魯氏不動桿菌方法的建立

張慧敏,夏海磊,王夢琦,邢世宇,毛永江,岑 寧,楊章平*

(揚州大學動物科學與技術學院,江蘇揚州 225009)

為建立魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)的快速檢測方法,本研究以A.lwoffii中的β-內酰胺酶基因(AL-blaOXA-134)為目的基因設計特異性引物,建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測A.lwoffii的方法。結果顯示,該方法可快速檢測A.lwoffii的存在,檢測靈敏度為2.4×102cfu/mL,建立的標準曲線為y=-3.838x+40.93,相關系數為0.993。與其他原料乳中常見的微生物均未發現交叉反應。人工陽性樣品乳中A.lwoffii的檢測限為2.4×103cfu/mL。最后,對2015年11月至2016年1月長江下游地區8個牧場的原料乳進行監測。結果表明該檢測方法具有較好的敏感性、特異性和實用性,為快速檢測原料乳中的A.lwoffii提供了有力的技術支撐,有利于保障原料乳的質量安全。

原料乳,熒光定量PCR,魯氏不動桿菌,β-內酰胺酶

魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)是革蘭氏陰性菌,普遍存在于水和土壤中,并可在0～5 ℃下繁殖,所以低溫食品極易受其污染,如奶制品、家禽及冷凍食品。此外,A.lwoffii是重要的機會致病菌,常引發敗血癥,肺炎,心內膜炎等[1-2]。A.lwoffii可產生耐熱的β-內酰胺酶,它可水解β-內酰胺類抗生素(如碳青霉烯類),引發人體過敏反應及耐藥性的增強。食品加工過程中的熱殺菌工藝可以破壞微生物,但這些耐熱酶的活性基本不受影響,給食品安全帶來巨大的隱患[3-4]。Machado等[5]發現了不動桿菌屬的微生物是原料乳低溫貯藏期間的主要嗜冷菌之一。而呂元[6]以杭州周邊牧場的原料乳為研究對象,經過微生物分離鑒定,確定A.lwoffii是優勢嗜冷菌之一,然而目前并未有基于分子生物學的A.lwoffii檢測方法的報道。由此可見,快速、準確地檢測原料乳中A.lwoffii含量對保障原料乳質量安全有重要意義。

隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應用,近年來細菌對該類抗菌藥物的耐藥率正在逐年上升。不動桿菌屬分泌的β-內酰胺酶是導致該菌抗生素耐藥性的重要機制,這些耐藥性菌株的出現給臨床治療帶來了很大挑戰[7-8]。常見的β-內酰胺酶主要包括A、B、D三類,其中B類(金屬酶)和D類(OXA型苯唑西林酶)常見于不動桿菌屬[9]。最近,在A.lwoffii中發現了一種新型的D類β-內酰胺酶基因(AL-blaOXA-134),可作為該菌的種間特異性識別基因[10-11]。本研究將根據AL-blaOXA-134設計一對特異性強的引物,以此建立熒光定量PCR檢測原料乳中A.lwoffii的方法,并對該方法的靈敏度及特異性進行評價,旨在形成一套快速、準確的A.lwoffii檢測方法,為原料乳的質量安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯氏不動桿菌ATCC15309、粘質沙雷氏菌ATCC14756、阪崎腸桿菌ATCC29544、熒光假單胞菌ATCC13525 美國模式培養物集存庫(American type culture collection);大腸桿菌JM109、金黃色葡萄球菌ATCC29213 本實驗室保藏;沙門氏菌ATCC13076、李斯特菌ATCC15313 揚州大學獸醫學院藥理與毒理實驗室提供;pUCm-T質粒 上海Sangon公司;DNA Taq酶、DNA純化試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)和1000 bp DNA Ladder Marker 大連TaKaRa公司;細菌基因組DNA提取試劑盒DP302 天根生化科技有限公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

臺式冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;梯度PCR儀 美國賽默飛世爾科技公司;熒光定量PCR擴增儀7500 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 首先根據A.lwoffiiATCC15309的β-內酰胺酶(AL-blaOXA-134)氨基酸序列(GenBank:WP_004728961),比對數據庫中的各種A.lwoffii,如A.lwoffiistrain St17095(GenBank:AHA11126.1)、A.lwoffiiAL3(GenBank:ADM47435.1)和A.lwoffiistrain S459(GenBank:ALM26450.1),找出種間保守序列區段。此外,將AL-blaOXA-134與不動桿菌屬其他菌株的β-內酰胺酶氨基酸序列進行比對,如鮑氏不動桿菌A.baumannii的blaOXA-23(GenBank:ABK34775、)和blaOXA-51(GenBank:4ZDX_A)及抗輻射不動桿菌A.radioresistens的blaOXA-23(GenBank:ACI26267),篩選同源性低的片段,最終對該段氨基酸序列的編碼區序列進行同源比對,設計引物。

1.2.2 DNA的提取 微生物DNA提取:所有細菌在最適液體培養基中培養過夜,取1 mL菌液收集菌體,參照細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

牛奶DNA提取:將原料乳進行離心(12000×g,5 min),棄上層脂肪,無菌生理鹽水洗滌兩次,12000×g離心2 min,然后采用文獻中報道的方法提取牛奶中的DNA[12]。

1.2.3 AL-blaOXA-134的擴增 以A.lwoffiiATCC15309的DNA為模板,利用引物AL-F和AL-R進行常規PCR,擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,割膠回收目的條帶。將純化的PCR產物直接與pUCm-T連接,轉化JM109感受態細胞;經藍白斑初選和PCR鑒定正確后,送上海Sangon公司測序。

1.2.4 熒光定量PCR標準曲線的建立 將A.lwoffiiATCC1530在腦心浸液培養基(BHI培養基)中過夜培養,用菌落平板記數法定量菌液,采用滅菌液體培養基進行10倍梯度稀釋,得到不同濃度菌液。采用1.2.2中的方法提取不同濃度菌液的基因組DNA,然后使用SYBR Green I實時定量PCR試劑盒進行PCR擴增。PCR體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,AL-F 0.8 μL,AL-R 0.8 μL,DNA模板 2.0 μL,ddH2O 6.0 μL,Rox Reference Dye Ⅱ 50 x 0.4 μL。PCR條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 34 s,40個循環;在55 ℃退火階段收集熒光值,并在上述擴增條件后增加60 ℃至95 ℃的融解曲線分析。得到每個濃度的Ct值,這個值對應熒光信號初次被檢測到時的循環數,可以反映模板初始量,以菌落數的lg值和Ct值制作標準曲線。

1.2.5 特異性實驗 利用1.2.2中的方法提取8種乳中常見微生物(粘質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、阪崎腸桿菌、熒光假單胞菌)的基因組DNA,并分別以其為模板,采用1.2.4中的熒光定量PCR方法對進行擴增,并選取A.lwoffii作為陽性對照,檢測該方法的特異性。

1.2.6 熒光定量PCR與普通PCR檢測方法靈敏度評價 以1.2.4中獲得的梯度濃度A.lwoffiiATCC15309基因組DNA為模板,AL-F和AL-R為引物進行常規PCR,其反應條件為:95 ℃ 3 min,30個循環(95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s),72 ℃ 10 min。評價熒光定量PCR與普通PCR檢測方法的靈敏度。

1.2.7 人工陽性樣品乳檢測 將1.2.4中已經定量的菌液,采用滅菌全脂乳進行10倍梯度稀釋,得到不同濃度菌液。采用1.2.2中的方法提取不同濃度菌液的基因組DNA,并按照1.2.4中的方法進行熒光定量PCR擴增。

1.2.8 熒光定量PCR檢測原料乳中的A.lwoffii分別于2015年11月、12月及2016年1月,從江蘇省長江下游地區8個奶牛場中采集桶樣原料乳,按照1.2.2中的方法提取奶樣DNA,進行熒光定量PCR,確定每個牧場的原料乳是否污染了A.lwoffii,以此監控每個牧場的奶源質量。

2 結果與分析

2.1 AL-blaOXA-134部分片段的克隆

同源比對結果顯示,AL-blaOXA-134(GenBank:WP_004728961)與其他A.lwoffii來源的blaOXA-134氨基酸序列同源性高達95%,存在較多相似區域。同時將AL-blaOXA-134與不動桿菌屬其他菌株的β-內酰胺酶氨基酸序列比對,發現它們的同源性較低,僅為57%,篩選其中同源性低的片段。結果如圖1所示,符合條件的片段大部分集中在N末端及C末端。根據熒光定量PCR對片段長度的要求,我們選取了保守序列“LFDQAQS”和“ATTNEIFKWDGKKR”為引物設計區域,根據其編碼區序列設計引物:AL-F(5′-TTATTTGATCAGGCGCAAAG-3′)和AL-R(5′-CGTTTCTTGCC ATCCCATTTA-3′),該引物擴增片段長度為197 bp。

圖1 不同來源的blaOXA-134氨基酸序列同源比對結果Fig.1 Amino acid homology alignment of AL-blaOXA-134 with other β-lactamases

以A.lwoffiiATCC15309的DNA為模板,利用引物AL-F和AL-R進行PCR,擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果如圖2(泳道1)所示,擴增產物在200 bp處有一特異性條帶,大小與預期一致,將PCR產物割膠回收后與pUCm-T連接,獲得重組質粒,并對其進行測序,測序結果表明AL-blaOXA-134部分基因片段長度為197 bp,與擬克隆的基因序列一致,說明AL-blaOXA-134基因序列擴增正確。

圖2 AL-blaOXA-134部分片段的PCR擴增Fig.2 The PCR amplification of partial fragment of AL-blaOXA-134

2.2 熒光定量PCR標準曲線

將A.lwoffiiATCC1530過夜培養,采用菌落平板記數法定量菌液濃度為2.4×107cfu/mL,經滅菌液體培養基稀釋后,得到不同濃度菌液(2.4×101、2.4×102、2.4×103、2.4×104、2.4×105、2.4×106、2.4×107cfu/mL)。以細菌數的lg值和Ct值制作熒光定量PCR的標準曲線:y=-3.838x+40.93,相關系數為0.993,表明不同梯度濃度細菌數的lg值與Ct值之間呈良好的線性關系。熒光定量PCR的Ct值與初始模板在6個lg濃度范圍內呈現良好的線性關系。當菌落數達到2.4×101cfu/mL,進行擴增后其Ct值大于水的Ct 值(圖3),故該濃度下不能對AL-blaOXA-134基因進行有效的檢測。由此可知,該檢測方法的最低檢測限可達到2.4×102cfu/mL。

圖3 熒光定量PCR擴增曲線圖Fig.3 Amplification curves of fluorescence quantitative PCR

2.3 熒光定量PCR檢測方法特異性評價

以9株菌株DNA為模板,進行熒光定量PCR擴增,其中只有A.lwoffiiATCC15309模板有典型熒光擴增曲線,而其它菌株均無熒光擴增曲線,為陰性結果(圖4)。同時,A.lwoffiiATCC15309特異性融解曲線Tm值為84 ℃左右,符合熒光定量PCR的融解曲線呈現單一峰形。說明該方法檢測A.lwoffiiATCC15309具有良好的特異性。

圖4 熒光定量PCR方法特異性驗證及A. lwoffii溶解曲線Fig.4 Specific curves of fluorescence quantitative PCR and melting curves of A. lwoffii

2.4 熒光定量PCR檢測方法靈敏度評價

由2.2可知,熒光定量PCR檢測A.lwoffiiATCC15309的靈敏度為2.4×102cfu/mL,然后以獲得的不同濃度菌液的基因組DNA為模板,AL-F和AL-R為引物進行常規PCR,比較常規PCR與熒光定量PCR的敏感性。由圖5可知,常規PCR檢測A.lwoffii的靈敏度是2.4×103cfu/mL,由此可見熒光定量PCR的靈敏度高。

表1 不同牧場不同月份原料乳中A. lwoffii熒光定量PCR檢測結果Table 1 The detection result of A. lwoffii in raw milk by fluorescence quantitative PCR in different pastures and different months

注:-表示未檢出。

圖5 普通PCR檢測AL-blaOXA-134的靈敏度Fig.5 The sensitivity of detection of AL-blaOXA-134 by conventional PCR

2.5 人工陽性樣品乳中A. lwoffii的檢測限

將初始濃度為2.4×107cfu/mL的菌液,經滅菌全脂乳梯度稀釋后,獲得不同濃度人工污染A.lwoffii的牛奶(2.4×101、2.4×102、2.4×103、2.4×104、2.4×105、2.4×106、2.4×107cfu/mL)。經預處理后提取基因組進行熒光定量PCR,結果顯示,當牛奶中污染細菌濃度大于2.4×103cfu/mL時,檢測樣品均獲得較好的熒光信號,且Ct值<29.12,因此確定人工陽性樣品乳中A.lwoffii的檢測限為2.4×103cfu/mL。

2.6 熒光定量PCR檢測原料乳中的A. lwoffii

收集2015年11月至2016年1月8個牧場的原料乳,然后提取DNA,利用本文中建立的方法對其進行檢測。結果如表1所示,11月份和12月份原料乳的Ct值均不在檢測范圍之內(Ct值>29.12),檢測不到A.lwoffii。而1月份所有8個牧場全都檢測出了A.lwoffii,且菌落數均超過了2.4×103cfu/mL。

3 討論與結論

在奶牛養殖過程中,由于抗生素的濫用,導致原料乳中抗生素殘留現象日益嚴重,在經濟利益的驅使下,可有效降解抗生素的β-內酰胺酶被違法添加,致使不合格的原料乳流入生產及消費環節。消費者食用后,可導致自身耐藥性增強,給食品安全帶來巨大隱患,因此,β-內酰胺酶被列入非法添加劑之列[13-14],目前,已經開發出許多方法來測定牛奶中的β-內酰胺酶含量,如杯碟法、HPLC及熒光探針法等[14-16]。除此之外,原料乳中的微生物也可以產生內源性β-內酰胺酶,如金黃色釀膿葡萄球菌、大腸桿菌、不動桿菌等[17-19]。因此,定量檢測這些微生物對乳制品的安全生產具有重要意義。

OXA型β-內酰胺酶是不動桿菌耐藥性的主要機制之一,根據氨基酸序列同源性,它可分為blaOXA-23、blaOXA-24/40、blaOXA-58及blaOXA-134等類型[19]。blaOXA-134是一大類A.lwoffii天然攜帶的OXA型β-內酰胺酶,可以用來做為A.lwoffii的鑒定標志。本研究采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對純培養物中的AL-blaOXA-134進行檢測,標準曲線相關性達到0.993,靈敏度達到2.4×102cfu/mL,比常規PCR方法靈敏度高10倍。而且該方法的特異性強,與其他原料乳中常見的微生物均未發現交叉反應。此外,人工陽性樣品乳中A.lwoffii的檢測限為2.4×103cfu/mL。李一松等[20]采用熒光定量PCR方法檢測乳中攜帶sea基因金黃色葡萄球菌,結果表明該方法的有效檢測限是8.3×102cfu/mL,比常規PCR方法靈敏度高100倍。劉繼超等[21]采用Taqman探針熒光定量PCR檢測乳中產腸毒素D的金黃色葡萄球菌,結果表明該方法在人工陽性樣品乳中金黃色葡萄球菌的有效檢測限是1.0×102cfu/mL。張巧艷等[22]針對沙門氏菌invA基因建立了熒光定量PCR快速檢測技術,該方法在原料乳中沙門氏菌檢的出限為102cfu/mL,而且檢測一個樣品僅需3 h。由此可見,熒光定量PCR方法可快速、準確地檢測原料乳中的微生物。

對長江下游地區8個不同牧場奶樣進行檢測時,1月份所有牧場原料乳中A.lwoffii檢測均呈陽性,且菌落數均超過了2.4×103cfu/mL,重復實驗結果也顯示為陽性。分析可能的原因是8個牧場同時出現了A.lwoffii,或者是原料乳被奶罐車中的A.lwoffii所污染。這就要求養殖場及加工廠應當規范生產操作,執行嚴格的防疫消毒制度,降低微生物污染幾率,提高原料乳的衛生質量[23]。

本研究建立的熒光定量PCR檢測原料乳中A.lwoffii的方法,具有良好的靈敏度和特異性。檢測方法簡單、快捷,能夠滿足乳制品行業對原料乳進行質量檢測的需要,對保障原料乳的質量安全有重要意義。

[1]Wang Y,Wu C,Zhang Q,et al. Identification of new delhi metallo-beta-lactamase 1 in Acinetobacter lwoffii of food animal origin[J]. Plos One,2012,7(5):37152.

[2]徐麗,呂瑞辰,王海燕,等. 攜帶blaNDM-1的質粒pNDM-BJ01在魯氏不動桿菌中的適應度代價[J]. 微生物學報,2013,53(1):99-104.

[3]謝鯤昊,滿朝新,盧雁,等. 原料乳中產β-內酰胺酶菌株的快速篩選和鑒定[J]. 食品科學,2013,34(7):162-165.

[4]楠丁呼思勤,母智深,陳芳,等. 影響牛奶品質耐熱酶的研究進展[J]. 食品工業科技,2007,4:244-246.

[5]Machado S G,Bazzolli D M S,Vanetti M C D. Development of a PCR method for detecting proteolytic psychrotrophic bacteria in raw milk[J]. International Dairy Journal,2013,29(1):8-14.

[6]呂元. 原料奶中嗜冷菌的快速檢測[D]. 杭州：浙江大學,2010.

[7]Hu Y,Zhang W,Liang H,et al. Whole-genome sequence of a multidrug resistant clinical isolate of Acinetobacter lwoffii[J]. Journal of Bacteriology,2011,193(19):5549-5550.

[8]王穆群,郭普,張永,等. 魯氏不動桿菌耐藥性研究[J]. 中華醫院感染學雜志,2015,25(3):514-515.

[9]Jacoby G A. Beta-lactamase nomenclature[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2006,50(4):1123-1129.

[10]Figueiredo S,Poirel L,Seifert H,et al. OXA-134,a naturally occurring carbapenem-hydrolyzing class Dβ-Lactamase from Acinetobacter lwoffii[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2010,54(12):5372-5375.

[11]Turton J F,Hyde R,Martin K,et al. Genes encoding OXA-134-like enzymes are found in Acinetobacter lwoffii and A. schindleri and can be used for identification[J]. Journal of Clinical Microbiology 2012,50(3):1019-1022.

[12]張軍偉. 牛奶中基因組DNA提取方法的建立及荷斯坦奶牛兩個候選基因多態性研究[D]. 武漢：華中農業大學,2009.

[13]周蕊,丁顥,周爽,等. 我國部分地區市售巴氏殺菌乳中β-內酰胺酶含量調查[J]. 中國食品衛生雜志,2014,26(3):209-212.

[14]張秀芹,李欣南,田穎,等. 生鮮牛乳中內源性β-內酰胺酶的研究[J]. 中國乳業,2009(11):58-59.

[15]Zhou S,Wang D,Zhao Y,et al. A rapid HPLC method for indirect quantification ofβ-lactamase activity in milk[J]. Journal of Dairy Science,2015,98(4):2197-2204.

[16]Chen Y,Xianyu Y,Wu J,et al. Point-of-care detection ofβ-lactamase in milk with a universal fluorogenic probe[J]. Analytical Chemistry,2016,88(11):5605-5609

[17]蔡興航,齊微微,姚宇秀,等. MALDI-TOF-MS對原料乳中產β-內酰胺酶菌株的鑒定[J]. 2016,44(1):12-14.

[18]Livermore D M,Woodford N. The beta-lactamase threat in Enterobacteriaceae,Pseudomonas and Acinetobacter[J]. Trends in Microbiology,2006,14(9):413-420.

[19]Li L,Ye L,Yu L,et al. Characterization of extended spectrum Β-Lactamase producing Enterobacteria and methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from raw pork and cooked pork products in south China[J]. Food science,2016,81(7):1773-1777.

[20]李一松,王明娜,呂琦,等. SYBR Green I熒光定量PCR檢測乳中攜帶sea基因金黃色葡萄球菌的研究[J]. 食品科學,2008,29(7):235-239.

[21]劉繼超,姜鐵民,劉豐,等. Taq Man探針熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌腸毒素D[J]. 食品工業科技,2014,35(21):159-161.

[22]張巧艷,陳亭亭,陳笑蕓,等. 基于SYBR Green I 熒光定量PCR建立生乳及乳制品沙門氏菌快速檢測技術[J]. 浙江農業學報,2012,24(5):914-921.

[23]劉雙虎,胡海燕,武志敏. 關于規模奶牛場建設和經營管理的建議[J]. 黑龍江畜牧獸醫,2014,1:29-30.

Study on fluorogenic quantitative PCR detection method ofAcinetobacterlwoffiiin raw milk

ZHANG Hui-min,XIA Hai-lei,WANG Meng-qi,XING Shi-yu,MAO Yong-jiang,Cen Ning,YANG Zhang-ping*

(Animal Science and Technology College,Yangzhou University,Yangzhou,225009)

In order to detect theAcinetobacterlwoffiiquickly and accurately,a real-time PCR detection based on SYBR Green Ⅰ was established with a pair of primers designed according to theβ-lactamase gene ofA.lwoffii(AL-blaOXA-134). The result showed that this method could detect theA.lwoffiiquickly in raw milk with a detection limit of 2.4×102cfu/mL,and without any cross-reaction to other microorganisms in raw milk. The standard curve was y=-3.838x+40.93,of which correlation coefficient was 0.993. The detection limit ofA.lwoffiiin artificial contaminated milk sample was 2.4×103cfu/mL by this method. Finally,milk sample collected from eight pastures in lower reaches of the Yangtze River since Nov.,2015 to Jan.,2016 was analyzed by this method. The method established in this study was specific,highly sensitive,which could be further used in detection ofA.lwoffiiin raw milk and helpful to improve the quality safety of raw milk.

raw milk;fluorogenic quantitative PCR;Acinetobacterlwoffii;β-lactamase

2016-07-14

張慧敏(1986-)，女，博士，講師，研究方向：畜產品安全生產及加工，E-mail:minmin-911@163.com。

*通訊作者:楊章平(1965-)，男，博士，教授，研究方向：動物遺傳育種與繁殖，E-mail:yzp@yzu.edu.cn。

江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室開放課題(K14008)；江蘇省博士后科研資助計劃(1501118B)；揚州大學交叉學科建設項目(jcxk2015-14)；江蘇省優勢學科項目(PAPD)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)03-0309-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.051