糧谷中嘔吐毒素管式化學發光免疫分析法的研究與應用

王毅謙,陳君義,龍云鳳,陸慧媛,方云濤,于 洋

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 210000;2.徐州出入境檢驗檢疫局,江蘇徐州 221006;3.揚州伊綠鮮生態農業科技有限公司,江蘇揚州 225000)

糧谷中嘔吐毒素管式化學發光免疫分析法的研究與應用

王毅謙1,陳君義2,龍云鳳1,陸慧媛1,方云濤1,于 洋3

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 210000;2.徐州出入境檢驗檢疫局,江蘇徐州 221006;3.揚州伊綠鮮生態農業科技有限公司,江蘇揚州 225000)

目的:建立一種準確度高、重復性優的快速檢測糧谷中嘔吐毒素(DON)的管式化學發光免疫分析法(CLIA)。方法:本研究基于抗原抗體的特異性反應,選擇磁性微粒為固相載體,通過優化磁微粒的稀釋度、反應時間等工作條件,建立了高準確度、重復性良好的DON-CLIA。結果:本研究建立的DON-CLIA的檢測范圍為5～185 ng/mL;最低檢測限為3.82 ng/mL(樣本檢測限為0.076 μg/g);準確度相對偏差為6.64%,重復性變異系數為2.32%,均小于10%;DON的添加回收率在90%～110%之間。結論:本研究建立的DON-CLIA的檢測范圍、檢測限、準確度、重復性、回收率,均符合實際工作的要求,是一種快速、高效、準確的化學發光免疫分析法,適用于大量樣本的DON含量的測定。

嘔吐毒素,化學發光,磁微粒

嘔吐毒素,又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是一種菌毒素,屬于單端孢霉烯族類化合物,伴隨著谷物的生長過程而產生,不易預防[1-2]。DON具有細胞毒性、胚胎毒性、致畸性、致癌性,能夠對多種動物造成多系統的毒性損傷,當動物中毒時首先表現為嘔吐[3]。由于DON具有很高的細胞毒性及免疫抑制性,因此,對人類及動物的健康構成了威脅,特別是對免疫功能具有明顯的影響[4]。根據DON的劑量和暴露時間不同,可引起免疫抑制或免疫刺激。當人攝入了被DON污染的食物后,會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩、反應遲鈍等急性中毒癥狀,嚴重時損害造血系統造成死亡[5]。由于中國傳統飲食習慣中糧谷比例大大高于西方,使得嘔吐毒素的危害更為突出。美國食品及藥物管理局(FDA)規定食物中嘔吐毒素的安全標準是1000 μg/kg,嘔吐毒素的含量超過l000 μg/kg就會對人及一些動物健康產生損害。因此,對于食品及原料中DON的檢測和控制是極為重要的,建立高效、快速的DON檢測方法具有重要的意義。

目前使用較多的DON檢測方法包括薄層色譜法、液相檢測法、液質聯用法和酶聯免疫分析法。薄層色譜法雖然操作簡便,曾被廣泛應用,但在檢測過程中操作人員必須直接接觸標準品,危害到操作人員的身體健康,處理樣品時工作量大,且在提取過程中需要使用大量的有機溶劑,這會對周圍環境產生不利影響。液相檢測法、氣相檢測法、液質檢測法[6-7]在實際應用中檢測靈敏度高,但需要較高的專業性需要昂貴精密的儀器,樣本的前期處理較為繁瑣,操作時需要專門的技術人員,不便推廣使用,此外也不適合大批量樣本檢測。酶聯免疫分析法以及金標法檢測方便、成本低,但靈敏度不高,反應時間較長,無法滿足現場檢測的需求[8-9]。

免疫檢測法靈敏、成本低、操作簡單,更適合大規模的普遍檢測。化學發光免疫測定法(CLIA)將化學發光和免疫技術相結合,具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡便快速、穩定性強特點。管式磁微粒CLIA是以磁性微粒為固相載體,基于抗原抗體特異性反應的免疫分析方法,其靈敏度較高,反應時間短,適用于大量樣本的檢測[10-11]。本研究利用磁性微粒連接DON作為載體,在U型反應管中進行抗原抗體免疫反應,通過對方法中磁微粒的稀釋度、反應時間等體系變化,建立了建立一種準確度高、重復性優的快速檢測糧谷中DON的管式化學發光免疫分析法(CLIA)(DON-CLIA),考察了DON-CLIA的檢測限、準確度、重復性、回收率等性能參數,并在實際應用中做了初步嘗試。DON-CLIA樣本處理簡單,檢測的成本低廉,檢測所需時間短暫,尤其適用于樣本的大批量篩檢。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基磁微粒 上海阿拉丁;DON標準品 美國sigma公司;DON-卵清蛋白交聯復合物 DON-OVA(實驗室自制),吖啶酯-抗DON單克隆抗體 實驗室自制。

磁微粒包被液:0.05 mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液,pH9.6;封閉液:1% OVA溶液;PBS溶液:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.4;PBST洗液:0.05%吐溫-20的PBS溶液,pH7.4;稀釋液:磷酸鹽緩沖液(PBS);CLIA發光啟動液:H2O2稀堿溶液;磁微粒活化液:50%戊二醛;磁微粒儲存液:甘氨酸-BSA溶液;樣本提取液:10%甲醇-PBS溶液。

NRM411化學發光儀 南京諾爾曼生物技術有限公司;FM-2粉碎機 上海科恒實業發展有限公司;TS100恒溫回旋震蕩器 杭州瑞誠儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DON-CLIA分析法建立

1.2.1.1 磁微粒載體包被方法 取1 mg磁微粒置于離心管中,磁分離去上清,加入活化液作用30 min,磁分離去上清,PBST洗滌2次,加入5 μg/mL DON-OVA溶液37 ℃恒溫回旋震蕩器上包被2 h,磁分離去上清,加入OVA溶液于37 ℃恒溫回旋震蕩器上封閉2 h,磁分離去上清,PBS洗滌2次,加入儲存液4 ℃保存。

1.2.1.2 DON-CLIA的反應過程 取預包被磁微粒2 μL,按照1∶200稀釋度PBS稀釋,磁分離去上清,加系列DON標準品或者待測樣本100 μL以及吖啶酯-抗DON單克隆抗體100 μL于37 ℃恒溫回旋震蕩器上反應15 min,加入100 μL CLIA發光啟動液,讀取發光值RLU。磁微粒包被和DON-CLIA反應過程如圖1所示。

圖1 DON-CLIA檢測法反應過程圖Fig.1 The reaction process of DON-CLIA

1.2.2 DON-CLIA最佳工作條件的確立

1.2.2.1 磁微粒稀釋度 將已包被好的DON磁微粒按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶300比例稀釋后分別加入0、400 ng/mL的DON標準品進行反應,測定發光強度RLU0、RLU400。

1.2.2.2 反應時間 確定磁珠稀釋度,加入0、400 ng/mL的DON標準品進行反應10、15、20、30 min,測定發光強度RLU0、RLU400。

1.2.3 DON-CLIA性能的測定 用PBS稀釋制備系列DON標準品0、50、100、200、400 ng/mL,按照本實驗的DON-CLIA檢測方法,確定標準曲線。

1.2.3.1 檢測范圍 根據擬合曲線,按照公式(IC(%)=(1-實驗組發光值/對照組發光值值)×100)計算不同濃度DON對抗原抗體結合反應的抑制率值,以IC5～IC90范圍為該方法的檢測范圍。

1.2.3.2 最低檢測限 用0 ng/mL校準品作為樣本進行檢測,重復測定20次,得出20次測量結果的發光值(RLU值),計算其平均值(M)和標準差(SD),得出M+2SD所對應的RLU值,根據試劑盒所用校準品的定標曲線方程,將M+2SD所對應的RLU值帶入上述方程中,求出對應的濃度值,即為檢測限。

1.2.3.3 準確度 取定值濃度樣本重復測量3次后,計算其平均值(M),根據公式B(%)=(M-T)/T×100計算測量濃度的相對偏差(B)。

1.2.3.4 重復性 用兩個定值濃度樣本重復測量10次,計算每個樣本10次測量濃度結果的平均值M和標準差SD,根據公式CV(%)=SD/M×100得出變異系數CV。

1.2.3.5 回收率 添加法配制高中低三個定值濃度樣本重復測量3次,計算每個樣本的3次測量濃度結果的平均值M,均值與實際添加濃度比值即為回收率。

1.3 樣本提取方法以及檢測

實驗樣本為小麥、玉米、豬配合飼料。DON易溶于水及有機溶劑,根據相關文獻[12]分析確立如下的樣本提取方法,取粉碎后的實驗樣本粉末5 g,用50 mL提取液震蕩30 min,離心15 min后,過濾后,取濾液備用,使用時稀釋一倍作為實驗樣本。本實驗選用了隨機選擇的市場上的5份小麥、5份玉米、5份豬配合飼料,前處理后作為實際樣本進行檢測,分別測定3次,在化學發光儀上獲得RLU值,根據實驗中建立的標曲回算出樣本的濃度值,再根據樣本的處理方法計算出實際樣本的嘔吐毒素的含量的測定值,計算其變異系數CV。

1.4 數據統計分析

數據處理圖表均由GraphPad Prism 5軟件完成,圖中數據以均值±標準差(Mean±SD)做出誤差棒顯示。表格中數據計算獲得均值和變異系數(CV)。該方法的標準曲線圖通過mELISA軟件獲得,其擬合方式為四參數擬合法。

2 結果與討論

2.1 DON-CLIA最佳工作條件的確立

2.1.1 磁微粒稀釋度 如圖2所示,在1∶200磁微粒稀釋度下,RLU0值最高,RLU400/RLU0最小,其靈敏度更高,由此確定磁微粒的最佳稀釋度為1∶200。

圖2 DON-CLIA檢測法磁微粒稀釋度確定Fig.2 The determination of magnetic particles dilution in DON-CLIA

2.1.2 反應時間 如圖3所示,在反應時間15 min后,隨著反應時間的延長RLU0數值變化趨于平緩,其靈敏度均符合要求,但考慮其檢測高效的原則下,選擇較短的反應時間。在反應15 min時RLU400/RLU0的比值較低,RLU0較高,都符合檢測要求,因此確定最佳反應時間為15 min。

圖3 DON-CLIA檢測法反應時間確定Fig.3 The determination of reaction time in DON-CLIA

2.2 DON-CLIA性能

該DON-CLIA檢測方法確定的標準曲線如圖4所示,其擬合曲線的相似度大于0.99。根據擬合曲線,獲得該檢測方法的檢測范圍為5～185 ng/mL。

圖4 DON-CLIA檢測法標準曲線Fig.4 Standard curve of DON detection by CLIA

測定獲得20份0 ng/mL校準品的發光值,經過計算得出本實驗的最低檢測限為3.82 ng/mL,即樣本檢測限為0.076 μg/g。

準確度實驗中,測定獲得3份200 ng/mL的定值樣本的發光值,經過計算其相對偏差為6.64%,小于10%。

重復性實驗中,測定獲得10份200 ng/mL和10份100 ng/mL的定值樣本的發光值,經過計算其變異系數分別為2.94%和2.32%,均小于10%。

回收實驗中,分別測定獲得3份11、33、100、300 ng/mL的定值樣本的發光值,經過計算,其回收率均在90%～110%之間,如表1所示。

表1 DON-CLIA的回收率Table 1 The recovery rate of DON in DON-CLIA

DON-CLIA檢測法檢測范圍、檢測限、準確度、重復性、回收率均符合了實際工作的要求。

2.3 DON-CLIA進行樣本檢測

表2 DON-CLIA檢測十幾樣本的回收率實驗結果Table 2 The recovery of DON in samples by DON-CLIA detection

如表2所示,為小麥、玉米和豬配合飼料的實際樣本的測定值,經過計算三者變異系數CV分別為均小于10%,該方法實際應用中可有較好的樣本檢測重復性;對于隨隨機獲得的5份小麥、5份玉米、5份豬配合飼料的均沒有發現有超出安全標準(1000 ng/g),該方法能較好的用于實際樣本中的DON含量的定量檢測。

3 結論

本研究通過優化磁微粒的稀釋度和反應時間,建立了高準確度、重復性良好的DON-CLIA。該方法特異性強,靈敏度高,檢測范圍為5～185 ng/mL;最低檢測限為3.82 ng/mL(樣本檢測限為0.076 μg/g);準確度相對偏差為6.64%,重復性變異系數為2.32%,均小于10%;DON的添加回收率在90%～110%之間。隨機選擇的市場上的15份樣本前處理后進行檢測,在實際樣本的分析中均能達到檢測要求。綜上所述,DON-CLIA樣本處理簡單,檢測的成本低廉,檢測所需時間短暫,尤其適用于樣本的大批量篩檢。

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Investigation and application of a tubular Chemiluminiscence immunoassay on detection of Deoxynivalenol

WANG Yi-qian1,CHEN Jun-yi2,LONG Yun-feng1,LU Hui-yuan1,FANG Yun-tao1,YU Yang3

(1.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210000,China;2.Xuzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xuzhou 221006,China;3.Efresh Eco-Agriculture Co.LTD,Yangzhou 225000,China)

Objective:To establish a high accurate and excellently repeatable tubular Chemiluminiscence immunoassay(CLIA)for rapid detection of Deoxynivalenol(DON)in cereals.Method:Based on the specific antigen-antibody reaction,magnetic particles were used as the solid phase carrier. The operating conditions,such as the concentration of magnetic particles and reaction time,were optimized. A high accurate tubular CLIA for quantifying of DON(DON-CLIA)in cereals was established. Result:This DON-CLIA showed an excellent performance in linear with range of 5～185 ng/mL. The limit of detection(LOD)was 3.82 ng/mL. Both relative deviation of accuracy(6.64%)and coefficient of variation of repeatability(2.32%)were less than 10%. The percent recovery of DON was 90%～110%. Conclusion:All performance parameters of DON-CLIA,such as detection range,LOD,accuracy,repeatability and recovery,areaccorded with requirement of DON detection. This DON-CLIA,with high sensitivity and specificity,is suitable for quantitative determination of DON in cereals.

Deoxynivalenol;Chemiluminiscence;magnetic particles

2016-08-04

王毅謙(1980-),女,碩士,高級工程師,主要從事糧油食品檢測工作,E-mail:w1000319@163.com。

江蘇出入境檢驗檢疫局科技項目(2015KJ25)。

TS210.7

A

:1002-0306(2017)03-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.048