固相萃取超高效液相色譜法檢測(cè)榨菜中氯吡苯脲的研究

吳 杰,楊文友,王曉歡,鄭 洋,王安良

(涪陵出入境檢驗(yàn)檢疫局,重慶涪陵 408000)

吳 杰1,楊文友1,王曉歡2,鄭 洋2,王安良2

(涪陵出入境檢驗(yàn)檢疫局,重慶涪陵 408000)

建立了固相萃取-超高效液相色譜法定榨菜中氯吡苯脲的方法。樣品勻漿后經(jīng)乙腈提取,固相萃取柱凈化后,在流動(dòng)相為乙腈-純水(體積比65∶35)、紫外檢測(cè)波長為260 nm的色譜條件下進(jìn)行分離檢測(cè)。結(jié)果表明:丙基乙二胺PSA分散固相萃取柱對(duì)樣品凈化效果好,氯吡苯脲在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r=0.9993,方法檢出限為0.03 mg/kg,試樣在0.1～1.0 mg/kg添加水平下的平均回收率在96.3%～103.2%之間,RSD值在0.4%～2.2%之間。結(jié)論:方法準(zhǔn)確度較好,操作簡(jiǎn)單快捷,樣品凈化效果好,測(cè)定低限能滿足限量要求。

榨菜,氯吡苯脲,固相萃取,超高效液相色譜法

氯吡苯脲俗稱膨大劑,是一種具有細(xì)胞分裂活性的低毒苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑[1],具有提高光合作用效率、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、防止落花落果、增大果實(shí)等作用[2],尤其對(duì)蔬菜、水果有著顯著的增產(chǎn)、增效作用[3],但是食用經(jīng)氯吡苯脲處理過的果實(shí)過多會(huì)危害人體健康,如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、腹瀉、兒童性早熟、腫瘤等[4]。美國環(huán)保署在《農(nóng)藥毒性確認(rèn)和管理》第5版13章指出,經(jīng)常性的接觸氯吡苯脲會(huì)使人體體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂、造成輕度的肺氣腫甚至體形消瘦。日本規(guī)定氯吡苯脲在香瓜和葡萄中的最大殘留限量(MRL)為0.1 mg/kg。韓國規(guī)定在葡萄中的MRL值0.05 mg/kg,而美國要求更為嚴(yán)格,僅為0.03 mg/kg。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,國內(nèi)主要使用配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)獼猴桃、西瓜、草莓等水果中氯吡苯脲殘留檢測(cè)進(jìn)行了研究,檢出限在0.02～0.05 mg/kg,也有少數(shù)采用液質(zhì)聯(lián)用研究水果中氯吡苯脲的殘留量檢測(cè)方法,檢出限能達(dá)到0.2～0.5 μg/kg[4-8],但是對(duì)榨菜中氯吡苯脲的殘留檢測(cè)及最大殘留限量(MRL)要求還未見報(bào)道。

涪陵榨菜是以根莖為主食部分的作物,一些種植者為了盲目追求高產(chǎn)及利潤,過度施加氯吡苯脲,加速果實(shí)膨大,美化榨菜外形,使其提前上市,導(dǎo)致氯吡苯脲的殘留超標(biāo)存在安全隱患,而涪陵榨菜每年種植面積達(dá)70萬畝,年產(chǎn)量超過150萬噸,遠(yuǎn)銷歐、美、日、韓等地區(qū),是廣大農(nóng)民增收致富的主要經(jīng)濟(jì)來源之一,為了保障榨菜產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展,有必要建立榨菜中氯吡苯脲的檢測(cè)方法作為榨菜產(chǎn)業(yè)安全的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、二氯甲烷,甲苯 均為色譜純,TEDLA公司;超純水 由密理博純水儀制得;氯化鈉 經(jīng)過120 ℃烘烤6 h后放置于干燥器中保存?zhèn)溆?分析純,上海化學(xué)試劑公司;無水硫酸鈉 經(jīng)過650 ℃烘烤6 h后放置于干燥器中保存?zhèn)溆茫治黾?上海化學(xué)試劑公司;丙基乙二胺PSA分散固相萃取柱;氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)品:CAS號(hào)68157-60-8,純度99.5%,Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

安捷倫1290超高校液相色譜儀,配有二極管陣列檢測(cè)器;色譜柱:AgiLent Zorbax XDB-C18柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);正壓固相萃取儀(JPPM);超聲波清洗機(jī)(SCQ-8201A);氮吹儀(N-EVAP TM112);氮?dú)獍l(fā)生器(DEG-200);旋渦振蕩器(XW-80A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制 準(zhǔn)確稱取1.0 mg氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制定 將氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液用甲醇分別稀釋成濃度為0.1,0.5,1,2,4,10 μg/mL系列標(biāo)液,經(jīng)濾膜過濾后,超高效液相色譜儀測(cè)定,以保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)加入法定性,峰面積定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 樣品提取:準(zhǔn)確稱取勻漿后的榨菜樣品5.00 g置于50 mL具塞離心管中,加入5.0 mL乙腈,渦旋振蕩2 min混勻,超聲20 min,取出后加入0.5 g氯化鈉,2 g無水硫酸鈉,渦旋振蕩2 min,在8000 r/min的條件下離心10 min,待凈化。

1.2.4 樣品凈化 方法一:將丙基乙二胺PSA分散固相萃取柱置于正壓固相萃取儀上,用4.0 mL淋洗劑(V甲醇∶V二氯甲烷=1∶9)預(yù)淋洗活化,取離心后上清液2 mL上柱,用3 mL淋洗劑洗滌樣品管后并入柱中,再用6 mL淋洗劑分3次進(jìn)行洗脫,洗脫液用15 mL離心管收集。將離心管置于氮吹儀上,40 ℃水浴,氮吹近干,用乙腈定容至2 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待上機(jī)檢測(cè);

方法二:將丙基乙二胺PSA分散固相萃取小柱置于正壓固相萃取儀上,用4.0 mL淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)預(yù)淋洗活化,取離心后上清液2 mL上柱,再用2 mL淋洗劑洗滌樣品管后并入柱中,最后用8 mL淋洗劑洗脫,洗脫液用15 mL離心管收集。將收集液置于氮吹儀,于40 ℃水浴,氮吹近干,用(V甲醇∶V水=1∶1)溶解殘留物定容至2 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 色譜條件 色譜柱:AgiLent Zorbax XDB-C18柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:V乙睛∶V水=65∶35;柱溫:25 ℃;檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器;波長:260 nm;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.6 實(shí)際樣品測(cè)定 采用所建立的方法對(duì)涪陵轄區(qū)榨菜樣品進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

采用上述色譜條件對(duì)氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),由圖1可見,氯吡苯脲的保留時(shí)間為4.141 min,峰形良好,呈高斯曲線分布,能準(zhǔn)確定性定量分析。

圖1 氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The choromatogram of forchlorfenuron standard

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化 乙腈,二氯甲烷都可以作為氯吡苯脲的提取溶劑,通過進(jìn)行樣品添加回收實(shí)驗(yàn),測(cè)定平均含量,計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。綜合考慮提取溶劑的極性、安全性、提取率,最終選擇了極性大,回收率高,相對(duì)安全的乙腈作為提取溶劑,見表1。

表1 不同提取溶劑的提取效果比較Table 1 Extraction effects by several extraction solvents

2.2.2 洗脫溶劑的優(yōu)化 由于榨菜中含有色素和糖類等干擾物質(zhì),采用了丙基乙二胺PSA分散固相萃取柱進(jìn)行凈化處理,并根據(jù)榨菜樣品特性,結(jié)合文獻(xiàn)[9-10]考察了淋洗劑(V甲醇∶V二氯甲烷=1∶9),淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)的洗脫效率。相同濃度的氯吡苯脲經(jīng)萃取柱萃取后,分別用這2種溶劑進(jìn)行洗脫,測(cè)定洗脫液的峰面積。結(jié)果表明,淋洗劑(V甲醇∶V二氯甲烷=1∶9)平均洗脫率86.7%,淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)的平均洗脫效率101.2%,因此選擇(V乙腈∶V甲苯=3∶1)作為洗脫劑。在3～15 mL范圍內(nèi)考察了淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)的用量對(duì)洗脫液峰面積的影響,結(jié)果如圖2所示,當(dāng)淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)用量低于10 mL時(shí),洗脫液峰面積隨淋洗劑用量增加而增加,當(dāng)淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)用量高于10 mL時(shí),洗脫液峰面積變化不大,因此本研究淋洗劑(V乙腈∶V甲苯=3∶1)用量選用10 mL。

圖2 洗脫體積對(duì)峰面積的影響Fig.2 Effect of eluate volume on peak area

2.3 色譜條件的優(yōu)化選擇

為了得到快速高效的色譜條件,結(jié)合榨菜樣品特性,分別對(duì)流動(dòng)相、流速進(jìn)行了優(yōu)化。依次選用不同比例的甲醇-水、乙腈-0.01 mol/L磷酸水、乙腈-0.15%甲酸水,乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行了一系列預(yù)分離實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,甲醇-水,乙腈-磷酸水作為流動(dòng)相時(shí),洗脫能力太強(qiáng),目標(biāo)物氯吡苯脲出峰時(shí)間早,且拖尾嚴(yán)重;乙腈-甲酸水為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)物氯吡苯脲出峰受干擾較嚴(yán)重,且峰形不好;而乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)峰附近無干擾,分離度好,通過調(diào)節(jié)V乙腈∶V水=(65∶35,80∶20,90∶10,95∶5)配比和流速,在V乙腈∶V水=65∶35,流速0.5 mL/min時(shí)目標(biāo)物氯吡苯脲峰形對(duì)稱,無拖尾,實(shí)現(xiàn)了完全分離,最后選用V乙腈∶V水=65∶35為方法流動(dòng)相。

2.4 方法的線性分析和檢出限

按1.2.4中的色譜條件,對(duì)1.2.2的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液過濾膜上機(jī)測(cè)定,每個(gè)濃度點(diǎn)做6次以上平行實(shí)驗(yàn),以氯吡苯脲質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程為:y=288.3x-27.11,其中y為峰面積,x為氯吡苯脲含量,見圖3。結(jié)果表明,氯吡苯脲濃度0.10～10.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9993。以3倍信噪比計(jì)算得到的方法檢出限為0.03 mg/kg,定量下限0.10 mg/kg。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 Calibration curve

2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度

方法的準(zhǔn)確度、精密度分別采用添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來衡量。準(zhǔn)確稱取勻漿后的榨菜樣品5.00 g,分別在0.10、0.20、1.0 mg/kg三個(gè)水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),加入一定量的氯吡苯脲標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定平均含量,并計(jì)算平均回收率。在相同條件下,每個(gè)添加濃度做至少6個(gè)平行樣,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

表2 氯吡苯脲的榨菜加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 The recovery and RSD of forchlorfenuron in mustard tuber(n=6)

由表2可知,本方法在低中高3個(gè)水平下,平均回收率在96.3%～103.2%之間,RSD值在0.4%～2.2%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用此方法檢測(cè)榨菜中氯吡苯脲的殘留量,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

根據(jù)涪陵榨菜種植基地分布情況,選取了榨菜種植的主要基地6個(gè),按照前面建立的分析條件,測(cè)定榨菜中氯吡苯脲的殘留量,由于樣品基體成分復(fù)雜,需要通過加標(biāo)定性,取榨菜樣品中分別添加已知量的不同濃度的氯吡苯脲標(biāo)樣,其峰與氯吡苯脲標(biāo)樣譜圖能很好的重合,氯吡苯脲的出峰時(shí)間為4.149～4.152 min,峰面積也按比例增加,見圖4～圖6。從表3結(jié)果可以看出,涪陵榨菜中少部分樣品有氯吡苯脲檢出,含量在0.101～0.130 mg/kg之間,說明存在殘留預(yù)警風(fēng)險(xiǎn),也有部分疑似檢出,說明今后監(jiān)管部門需要加強(qiáng)管控。

圖4 榨菜中氯吡苯脲檢測(cè)的色譜圖Fig.4 The choromatogram of sample

圖5 樣品加標(biāo)色譜圖(4 μg/mL)Fig.5 The chromatogram of added standard(4 μg/mL)

表3 榨菜樣品中氯吡苯脲的殘留檢測(cè)結(jié)果Table 3 Residues of forchlorfenuron in mustard tuber

注:ND-表示檢測(cè)結(jié)果小于方法檢出限0.03;*-表示疑似檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了榨菜中氯吡苯脲的超高效液相色譜檢測(cè)方法。方法線性好,精密度、準(zhǔn)確度高,適用于榨菜中氯吡苯脲的分析檢測(cè),但是方法檢出限還不夠低,洗脫溶劑上還選用了有毒溶劑甲苯與乙腈,在將來還有待進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化。

此外,涪陵榨菜不僅僅局限于重慶種植,現(xiàn)在已經(jīng)推廣種植于全國17個(gè)省市,更是國家級(jí)出口質(zhì)量安全示范區(qū),有必要建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法,并設(shè)立MRL參考值,同時(shí)加強(qiáng)管控,保障整個(gè)榨菜產(chǎn)業(yè)的安全,促進(jìn)榨菜產(chǎn)業(yè)平穩(wěn)健康發(fā)展。

圖6 樣品加標(biāo)色譜圖(2 μg/mL)Fig.6 The chromatogram of added standard(2 μg/mL)

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Study on determination of forchlorfenuron in mustard tuber by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography

WU Jie1,YANG Wen-you1,WANG Xiao-huan2,ZHENG Yang2,WANG An-liang2

(Fuling Entry-exit Inspection Quarantine Bureau,Fuling 408000,China)

A method of solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography coupled with diode array detection was established for the determination of forchlorfenuron in mustard tuber. The sample was extracted with acetonitrile,and cleaned up with solid-phase extraction column. Forchlorfenuron was determined by ultra performance liquid chromatography at 260 nm using acetonitrile-water(65∶35)as mobile phase. The results indicated that the PSA solid-phase extraction column was more effective than others,and the calibration curve showed good linearity when the amount of forchlorfenuron was in the range of 0.1～10.0 μg/mL,with correlation coefficient of 0.9993,and detecting limit of forchlorfenuron were 0.03 mg/kg,and the average recoveries ranged from 96.3% to 103.2%,with the relative standard deviation(RSD)of 0.4%～2.2%. Conclusion:The result demonstrated that the method was simple,accurate and suitable for the identification and quantification of forchlorfenuron in mustard tuber.

forchlorfenuron;mustard tuber;solid-phase extraction;ultra performance liquid chromatography

2016-08-01

吳杰(1982-)，男，碩士研究生，工程師，主要從事食品安全檢測(cè)分析工作，E-mail：wujie100123@163.com。

重慶市應(yīng)用開發(fā)(重大)科技項(xiàng)目(CSTC2013YYKFC80004)；涪陵區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(FLKJ,2016ABB1052)；國家質(zhì)檢總局“35歲以下青年人才項(xiàng)目”(2014IK116)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)03-0286-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.046