蠅蛆肽對衰老小鼠的作用及機制的初探

文 雪，魏 洪，趙春江，朱麗華，曹 梅，劉玉江

(貴州醫科大學,貴州貴陽 550004)

蠅蛆肽對衰老小鼠的作用及機制的初探

文 雪，魏 洪*，趙春江，朱麗華，曹 梅，劉玉江

(貴州醫科大學,貴州貴陽 550004)

目的:探討蠅蛆肽對衰老小鼠的作用及其機制。 方法:將60只小鼠隨機分為6組,除空白組外,其余五組用D-半乳糖致衰老,分為衰老模型組、維生素C組以及蠅蛆肽低、中、高劑量組(2、4、8 g/kg)。測定小鼠的脾臟和胸腺指數。采用羥胺法測定小鼠肝臟和腦及血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活力,可見光法測定過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力,以硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)的含量。 結果:與空白組相比,模型組小鼠脾指數、胸腺指數及肝臟指數均有顯著降低(p<0.05),蠅蛆肽低、中、高劑量組臟器指數顯著增高(p<0.05)。與空白組比較,模型組肝、腦中SOD、CAT、GSH-Px均降低,且MDA含量增高(p<0.05),血清中SOD、CAT降低、MDA含量增高(p<0.05);與模型組比較,蠅蛆肽低、中、高劑量組肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px均顯著增高、MDA含量顯著降低(p<0.05),血清中SOD、CAT顯著增高、MDA含量顯著降低(p<0.05)。結論:蠅蛆肽通過改變衰老小鼠的臟器指數而對其產生免疫調節作用,可顯著提高小鼠肝臟和腦組織中的SOD、CAT、GSH-Px的活力,降低MDA的含量(p<0.05),從而改變機體抗氧化能力。蠅蛆肽對衰老小鼠的影響機制可能與增強其體內抗氧化酶活力及改變臟器指數相關。

蠅蛆肽,D-半乳糖,超氧化物歧化酶,過氧化氫酶,丙二醛

隨著中國人口步入老齡化階段,越來越多的人關注衰老話題,近年來關于衰老的研究已成為當前醫學研究領域的焦點。衰老的機制存在很多假說,如衰老的自由基學說、免疫學說等。但衰老產生的確切機制尚未研究清楚。家蠅幼蟲(Musca larva)[1]體內營養物質十分豐富,功能成分物質研究報道較多,如蠅蛆肽對大鼠的免疫調節作用[2]、家蠅抗菌肽提取物對腫瘤細胞具有抑制生長的作用[3]、家蠅幼蟲提取物清除氧自由基的作用[4]以及家蠅幼蟲水解物組成及功能[5]等多方面的研究,關于蠅蛆肽的抗衰老作用及其機制的研究尚未見報道。

表1 蠅蛆肽在實驗期間對小鼠體重的影響Table 1 Effect of fly maggot peptide on the weight of aged

本研究參考徐淑云的藥理實驗方法學[6],通過動物實驗,建立亞急性衰老模型,觀察蠅蛆肽[7-8]的功效及其劑量效應關系,觀察蠅蛆肽對衰老小鼠的SOD、CAT、GSH-Px的活力和MDA的含量及臟器指數的影響,并初步從氧化-抗氧化系統方面探討其作用機制,以期能為開發蠅蛆肽作為抗氧化產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

D-半乳糖 GENVIEW公司,批號4304020140;維生素C 東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,批號5131035;超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶系(GSH-Px)測試盒和丙二醛(MDA)測試盒和考馬斯亮蘭法蛋白質測試盒 南京建成生物工程研究所,批號20150250、20150250、20150218、20150219、20150430;實驗動物 昆明種小鼠(體質量(32±2) g),雌雄各半,由貴州醫科大學動物實驗中心提供,合格證號:SCXK(黔)2012-0001。

UV-1200紫外分光光度計 上海美析儀器有限公司;超低溫冰箱 東莞市昊昕儀器設備有限公司;超純水儀 山東新瑞分析儀器有限公司;超凈工作臺杭州南博皖實驗設備有限公司;全自動高壓滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司;離心機 安徽中科佳科學儀器有限公司;HH-600恒溫水箱 金壇市城西富威實驗儀器廠;不銹鋼立式電熱干燥箱 上海實貝設備儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠅蛆肽的制備 將由26個氨基酸構成的蛋白序列,采用fmoc策略固相多肽化學合成(深圳博潤思達生物科技有限公司)[9]。

1.2.2 亞急性衰老模型建立D-半乳糖致衰老小鼠模型,皮下注射D-半乳糖致小鼠免疫器官萎縮是導致衰老的主要原因之一。除空白對照組外,其余五組頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg·d-1,空白對照組頸背部皮下注射等量生理鹽水,共六周[10-13]。

1.2.3 分組及給藥 60只昆明種小鼠隨機分為6組,每組十只:空白對照組(K組)、衰老模型組(A組)、維生素C組(V組)以及蠅蛆肽低、中、高劑量組(L組2 g/kg、M組4 g/kg、H組8 g/kg)。從造模第三周開始分別對L、M、H組進行灌胃給藥2、4、8 g/kg·d-1蠅蛆肽,V組給予等量100 mg/mL維生素C,K、A組灌胃給予等量蒸餾水,共四周。小鼠每周定時測體重的變化。

1.3 臟器指數的測定

稱小鼠體重,摘取小鼠眼球取血,解剖取腦、胸腺、脾、肝臟并稱重。計算臟器指數:臟器濕重(mg)/體重(g)

1.4 肝臟組織SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的測定

將已稱重的肝臟加預冷的生理鹽水研磨制備成10%的組織勻漿。3000 r/min離心取上清液,檢測方法參照各試劑盒說明書。

1.5 腦組織SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的測定

將小鼠斷頭,解剖取出腦,稱重后加預冷的生理鹽水研磨制備成10%的組織勻漿,3000 r/min離心取上清液。檢測方法參照各試劑盒說明書。

1.6 血清SOD、CAT活力和MDA含量的測定

將小鼠眼球采血,3000r/min離心取上清液。參照各試劑盒說明書方法測定各指標。

1.7 數據統計

2 結果與分析

2.1 蠅蛆肽對小鼠體重的影響

蠅蛆肽各給藥組小鼠體重均無顯著性差異(p>0.05),說明蠅蛆肽對小鼠的生長發育無不良影響。見表1。

2.2 蠅蛆肽對衰老模型小鼠脾指數和胸腺指數的影響

胸腺作為機體重要的免疫器官,是T淋巴細胞分化和成熟的場所,其功能與免疫密切相關,它會隨著年齡的增加而逐漸退化萎縮,到老年期幾乎為脂肪組織代替。脾臟為外周免疫器官,可隨年齡的增加逐漸縮小,性質發生改變,也可能是衰老時免疫功能降低的原因之一。本實驗結果表明:與K組相比,A組小鼠脾指數、胸腺指數及肝臟指數均有顯著降低(p<0.05);與A組比較,M、H、V組和L組脾指數皆有顯著性增高(p<0.05),M、H、V組的小鼠肝臟和胸腺指數極顯著增大(p<0.01)。且M、H、L組的增高程度小于V組(見表2)。

表2 蠅蛆肽對衰老小鼠臟器指數的影響Table 2 Effect of fly maggot peptide on organism index of aged

注:與K組比較,1)表示差異顯著,2)表示差異極顯著;與A組比較,*p<0.05,**p<0.01,表3～表5同。

表3 蠅蛆肽對衰老小鼠肝臟組織影響Table 3 Effect of fly maggot peptide in liver of aged

表4 蠅蛆肽對衰老小鼠腦組織的影響Table 4 Effect of fly maggot peptide in brain tissue of aged

2.3 蠅蛆肽對小鼠肝臟組織的影響

隨著機體的衰老,體內抗氧化酶活力下降,過氧化物生成增多,氧自由基的大量集聚導致細胞損傷。本實驗結果顯示:與K組相比,A組肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(p<0.05),且MDA含量增高(p<0.05),提示造模成功;與A組比較,蠅蛆肽組小鼠肝臟中SOD、CAT及GSH-Px的活力增高、MDA含量減少(p<0.05,p<0.01)。說明蠅蛆肽具有抗脂質過氧化損傷作用(表3)。

2.4 蠅蛆肽對小鼠腦組織的影響

SOD是體內抗自由基防御體系中最重要的酶類抗氧化劑,可直接清除超氧陰離子自由基,保護組織免受超氧陰離子的損傷。CAT和GSH-Px是機體內廣泛存在的重要的催化H2O2的酶,具有保護細胞結構和功能的作用[11]。本實驗結果提示:與K組比較,A組腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著降低(p<0.05),且MDA含量增高,說明造模成功;與A組比較,L、M、H、V組小鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著性增高(p<0.05,p<0.01),且MDA含量較A組低(p<0.05,p<0.01)(表4)。

2.5 蠅蛆肽對小鼠血清的影響

MDA是過氧化脂質的降解產物,其含量可以間接反映出機體受自由基損傷的程度,被認為是衰老的生化指標[12]。實驗結果顯示:與K組比較,A組血清中SOD、CAT均降低,且MDA增高(p<0.05),L、M、H、V組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性增高,MDA含量均降低(p<0.05,p<0.01)。說明蠅蛆肽可顯著降低機體體內脂質過氧化物的含量,從而增強機體抗氧化能力(表5)。

表5 蠅蛆肽對衰老小鼠血清的影響Table 5 Effect of fly maggot peptide

3 結論與討論

衰老的自由基學說已經得到國內外學者的一致公認,自由基作為生物代謝過程中不斷產生的損害自身的毒性產物,在衰老過程中,自由基的含量隨著年齡的增高而增多,大量研究表明,SOD、CAT、GSH-Px作為機體重要的抗氧化酶,可直接清除超氧陰離子自由基,保護組織免受損傷,其活性間接反映了機體抗氧化的能力,可作為研究衰老與抗衰老的經典指標。衰老的免疫學說認為:機體免疫功能低下是導致衰老及多種老年性疾病的重要原因之一[14]。李玲玲[15]在蠅蛆肽的生物活性研究中,以SD大鼠作為研究對象,將實驗前與實驗期的大鼠比較,得出大鼠血清及組織中SOD、CAT、GSH-Px活力都顯著增高,本實驗選取經典的抗衰老方法及指標,針對蠅蛆肽對衰老小鼠的作用進行研究,實驗結果表明:蠅蛆肽可使D-半乳糖所致的衰老小鼠血清、肝、腦中SOD、CAT活力增高(p<0.05),與上述實驗結果相似。MDA能使膜交聯和聚集,并最終導致DNA的交聯,引起突變,使細胞結構和功能破壞[16]。本實驗結果表明:蠅蛆肽可使D-半乳糖所致衰老小鼠的血清、肝、腦中MDA含量明顯降低(p<0.05)。說明蠅蛆肽可提高小鼠體內抗氧化酶活力,有效清除氧自由基,增強機體的抗氧化能力。

綜上所述,蠅蛆肽通過改變衰老小鼠的臟器指數而對其產生免疫調節作用,可顯著提高小鼠肝臟和腦組織中的SOD、CAT、GSH-Px的活力,降低MDA的含量(p<0.05),從而改變機體抗氧化能力。蠅蛆肽對衰老小鼠的影響機制可能與增強其體內抗氧化酶活力及改變臟器指數相關。但蠅蛆肽增強抗氧化酶活力的機制尚未研究清楚。此外,衰老產生機制存在多種假說,蠅蛆肽的延緩衰老機制仍需今后的研究來進一步闡述,比如有無影響神經細胞內的Ca+2濃度、鈣通道、凋亡基因及凋亡抑制基因等。對蠅蛆肽延緩衰老作用及其作用機制的深入研究將為衰老的相關研究進展提供重要參考。

[1]Tang Y,Wang Y,Pei Z.A serine protease inhibitor from musca domestic larva exhibitsinhibitory activity against elastase and chymotrypsin[J].Biotechnology Letters,2016,38(7):1-7.

[2]國果,吳建偉,付萍，等.家蠅幼蟲分泌型抗菌肽對小鼠免疫功能的影響[J].中國公共衛生，2012,28(5):570-573.

[3]焦麗萍.家蠅幼蟲抗菌肽defensin基因的克隆、表達、純化及抑菌、抑腫瘤活性研究[D].山西:山西醫科大學,2013:61-74.

[4]趙啟龍,史彬林,張鵬飛，等.殼聚糖對雞蛋品質及蛋黃抗氧化功能的影響[J].營養飼料，2015,51(11):60-63.

[5]Juan Wang,Yansheng Wang,Xiangli Dang,et al. Housefly larvae hydrolysate:orthogonal optimization of hydrolysis,antioxidant activity,amino acid composition and functional properties[J]. BMC Research Notes，2013,6(197):1-10.

[6]徐淑云,陳修.藥理實驗方法學[M].第三版.北京:人民衛生出版社,2002:1464-1465.

[7]王麗媛.家蠅幼蟲酶解物的制備及其抗氧化活性的研究[D].大慶:黑龍江八一農墾大學,2010:33-46.

[8]Fu P,Wu JW,Guo G,et al.Purification and molecularidentification of antifungal peptide from thehemolymph of Musca domestic(housefly)[J].Cellular and Molecular Immunology,2009,6(4):45-48.

[9]宋曉驥,王立策.多肽固相合成[J].黑龍江科技信息,2011,(31):69-69.

[10]黃雙.D-半乳糖致小鼠衰老模型劑量和給藥方式探討[D].廣西:廣西醫科大學,2014:17-49.

[11]翟躍芬,吳海琴,呂多，等.EPO的抗衰老作用及其作用機制的初步探討[J].四川大學學報(醫學版),2012,43(5):679-682.

[12]張鐘,高紅梅,葉林杰.玉米多糖的抗衰老作用[J].中國糧油學報,2014,29(7):18-21.

[13]耿廣琴,楊雅麗,王晶，等.黨參水提取物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結構的影響[J].中醫研究，2014,27(7):70-74.

[14]蘆琳琳.紅景天的抗衰老作用:口服紅景天改善老齡大鼠免疫反應和增強谷氨酰半胱氨酸連接酶活性[D].山東:中國海洋大學,2013:24-44.

[15]李玲玲.蠅蛆肽的酶法制備及其對大鼠營養作用、生物活性的研究[D].黑龍江:黑龍江八一農墾大學,2008:31-37.

[16]楊春.外源性脂肪源干細胞移植改善D-半乳糖致衰老大鼠性能力的研究[D].廣東:南方醫科大學,2013:20-24.

Study on fly maggot peptide on aging model mice and its mechanism

WEN Xue,WEI Hong*,ZHAO Chun-jiang,ZHU Li-hua,CAO Mei,LIU Yu-jiang

(Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective:To study the effect of the fly maggot peptide on the of aging mice and the related mechanism. Methods:60 mice were randomly divided into six groups. Except the blank group,the other five groups including aging model group,vitamin C group and fly maggot peptides of low,middle and high dose group(2,4,8 g/kg/d)were induced aging withD-galactose. The spleen and thymus index of mice were measured. The hydroxylamine method was used to determine the superoxide dismutase(SOD)activity in mice’s liver,brain and serum. The activity of catalase(CAT)and glutathione peroxidase(GSH-Px)was determined by the visible light method,the content of malondialdehyde(MDA)was determined using thiobarbituric acid(TBA)method. Results:Compared with the blank group,the spleen index,thymus index and liver index of model group were reduced significantly,and the fly maggot peptides of low,middle and high dose group organ index were significantly increased(p<0.05). Compared with the blank group,the SOD,CAT,GSH-Px in liver,brain of model group were decreased,and MDA was increased(p<0.05),CAT,SOD in serum were decreased,MDA content was increased(p<0.05).Compared with the model group,SOD,CAT,GSH-Px in liver and brain tissue of low fly maggot peptides,and the high dose group were significantly increased,MDA content was decreased significantly(p<0.05). SOD,CAT content in serum were significantly increased,MDA in serum was reduced(p<0.05). Conclusions:Fly maggot peptides can affect immune function of aging mice by changing the organ index of aging mice,change the antioxidant capacity by increasing the activity of SOD,CAT,GSH-Px in liver and brain tissue and reducing the content of MDA. The influence mechanism of fly maggot peptides on aging mice may be associated with the increasing of the activity of antioxidative enzyme and organ index change.

Fly maggot peptide;D-galactose;superoxide dismutase;catalase malondialdehyde

2016-04-27

文雪(1995-)，女，在讀本科生，研究方向：功能食品開發,E-mail:1320123599@qq.com。

*通訊作者:魏洪(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：天然藥物開發，E-mail:hongweitian-2001@163.com。

貴州省2014年大學生創新創業訓練計劃項目(201410660019)；教育部2016年高校大學生創新創業訓練計劃項目(201610660310)。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)03-0361-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.062