河蜆多肽的制備工藝

趙 琪,杜雨芊,楊玉孌,陳麗麗,袁美蘭,趙 利,*

(1.江西科技師范大學生命科學學院,國家淡水魚加工技術研發分中心(南昌),江西南昌 330013;2.南昌市食品化妝品監督所,江西南昌 330038)

河蜆多肽的制備工藝

趙 琪1,杜雨芊2,楊玉孌1,陳麗麗1,袁美蘭1,趙 利1,*

(1.江西科技師范大學生命科學學院,國家淡水魚加工技術研發分中心(南昌),江西南昌 330013;2.南昌市食品化妝品監督所,江西南昌 330038)

以酸溶性多肽得率(TCA-SN)為指標,研究河蜆多肽的制備工藝.比較了中性蛋白酶Neutrase、復合蛋白酶Protamex、堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶Papain對河蜆蛋白的水解效果,考察了加酶量、pH、溫度、時間、底物濃度五種因素對Alcalase堿性蛋白酶酶解過程的影響,采用正交實驗優化法確定堿性蛋白酶Alcalase最佳酶解工藝條件為:酶解溫度55 ℃,加酶量3%,底物濃度2%,起始pH8.5,酶解時間為3 h;在此條件下酸溶多肽的得率為29.65%。再利用大孔樹脂吸附法對河蜆多肽進行分離,比較SQD-67、DA201-A、DA201-DⅡ、DA201-M和DA201-H幾種樹脂對河蜆多肽的吸附性能,最終確定大孔吸附樹脂DA201-C的最佳吸附條件為:上樣流速1 BV/h,上樣濃度30 mg/mL,乙醇洗脫濃度為75%,洗脫液經減壓濃縮、冷凍干燥得到河蜆多肽,其純度為82.19%。

河蜆,酶解,大孔樹脂,分離,多肽

河蜆蛋白質含量豐富,其粗蛋白含量占干重的66%以上[1]。這些蛋白中含有大量的生物活性肽,活性肽是由20種天然氨基酸以不同的組成和排列方式構成的環形或線性肽類的總稱,源于蛋白質的功能性化合物,而活性肽在母體蛋白中通常沒有活性[2],因此生物活性肽的制備引起越來越多的學者關注和研究。目前制備生物活性肽的最常用方法是酶水解法,經酶解所得肽具有良好的理化性質和功能性質[3]。趙樹民[4]等通過酶解蝌蚪提取多肽的方法制備得到一種抗氧化活性的蝌蚪酶解多肽提取物,其對肺泡II型上皮細胞具有保護作用,能夠用于預防和治療肺損傷;杜云建[5]等采用復合蛋白酶酶解草魚魚鱗制備多肽,研究發現其清除羥自由基能力提高;鄧尚貴[6]等以南海低值魚蛋白為原料,采用木瓜蛋白酶和風味酶的復合酶水解得到多肽水解物,并制備多肽發現其抗氧化性和抗菌功能特性明顯增加。多肽的分離純化方法主要有超濾法、大孔吸附樹脂法、凝膠過濾層析法、反相高效液相色譜法等[7]。大孔吸附樹脂吸附性強、解析容易、條件溫和設備簡單,是最常見的分離多肽方法之一,其作用機制是通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而完成吸附和解析,吸附與解析過程可逆的[8]。本文研究了河蜆蛋白的酶水解工藝,并在此基礎上研究大孔吸附樹脂對河蜆多肽的吸附解析性能,通過對其吸附解析工藝的探討對河蜆多肽進行分離,經后續旋蒸濃縮冷凍干燥得河蜆多肽產品。

表1 不同蛋白酶的水解參數[9]Table 1 Hydrolysis parameter of several protease[9]

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮河蜆,殼長1.5～2.5 cm采于鄱陽湖水域。

中性蛋白酶Neutrase(1.5 AU-A/g)、復合蛋白酶Protamex(1.5 AU-A/g)、堿性蛋白酶Alcalase(2.4 AU-A/g) 丹麥諾維信有限公司;木瓜蛋白酶Papain(0.08 AU-A/g) 南京龐博生物工程有限公司;SQD-67、DA201-A、DA201-DⅡ、DA201-M、DA201-H和DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團有限公司;其他試劑均為分析純 南康市華億化工有限公司。

DELTA-320型精密pH計 梅特勒-托利多公司;85-1型磁力攪拌器、HH-4型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;HZ-8812S型恒溫水域振蕩器 太倉市科教器材廠;DBS型電腦全自動部分收集器、DHL-B型電腦定時恒流泵、HD-3型紫外檢測儀 上海滬西分析儀器有限公司;φ2.5 cm×60 cm層析柱 上海華美實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 DH的測定 以三氯乙酸沉淀法[10]來表征河蜆蛋白的(DH)。三氯乙酸可溶性氮含量(TCA-SN)是指,在特定條件下,三氯乙酸(TCA)水溶液中可溶性氮的含量[11-12]。河蜆蛋白的水解是在一定底物濃度下,調至適宜溫度及適宜pH,然后按比例加入適量的酶水解一定時間后,在90 ℃水浴條件下滅酶20 min,取10 mL上清液加10 mL濃度為10%的三氯乙酸,搖勻靜止30 min,在5000 r/min下離心15 min,取上清液用凱氏定氮法測蛋白質含量[13],TCA-SN(%)的計算公式[14]如式(1):

式(1)

式中:w-蛋白質的質量分數,%;c-鹽酸標準滴定溶液濃度(mol/L);V1-樣品滴定消耗鹽酸標準溶液體積(mL);V2-空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積(mL);m-樣品的質量(g);0.0140-氮的毫摩爾質量(g/mmol);F-蛋白質系數。

式(2)

式中:c為TCA溶液中可溶蛋白濃度(mg/mL);v為溶液總體積(mL);m為樣品中蛋白質質量(g)。

1.2.2 酶的選擇 分別稱取200 g河蜆勻漿,放入4個500 mL燒杯中,加適量的蒸餾水將其配制成蛋白質含量為2%的河蜆勻漿懸液,置于磁力攪拌器上,調節溫度為50 ℃預熱5 min,分別加入堿性蛋白酶Alcalase、復合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase、木瓜蛋白酶Papain,加酶量為河蜆蛋白質質量的2.0%,同時調節體系pH分別維持在每種酶的最適pH處,酶解3 h后,在90 ℃水浴鍋中滅酶20 min,冷卻至室溫后取10 mL上清液加10 mL三氯乙酸(10%),搖勻靜止30 min,在5000 r/min下離心15 min,取上清液用凱氏定氮法測蛋白質含量并計算TCA-SN指數,確定最佳水解酶。

1.2.3 河蜆蛋白酶解條件的選擇 以底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間為單因素,研究它們對河蜆蛋白酶解效果的影響,從而確定堿性蛋白酶酶解河蜆蛋白的最適條件。

1.2.3.1 酶解時間對蛋白質水解過程的影響 稱取河蜆漿200 g,加適量的蒸餾水將其配制成蛋白質含量為2%的河蜆勻漿懸液,置于磁力攪拌器上,調節溫度為50 ℃,同時調節體系pH8.5,加酶量為2.0%,每隔0.5 h取出10 mL上清液經滅酶后測其TCA-SN指數,以時間為橫坐標,以TCA-SN指數為縱坐標繪制酶反應曲線,確定最佳水解時間。

1.2.3.2 酶解溫度對蛋白質水解過程的影響 分別稱取200 g河蜆漿,放入5個500 mL燒杯中,加適量的蒸餾水將其配制成蛋白質含量為2%的河蜆勻漿懸液,置于磁力攪拌器上,調節體系pH8.5,置于磁力攪拌器上,溫度分別設定為35、40、45、50、55 ℃下酶解,加酶量為2.0%,酶解時間為3 h。

1.2.3.3 加酶量對蛋白質水解過程的影響 分別稱取200 g的河蜆漿,放入5個500 mL燒杯中,加適量的蒸餾水將其配制成蛋白質含量為2%的河蜆勻漿,調節體系pH8.5,溫度為50 ℃,時間3 h,加酶量分別為河蜆蛋白質含量的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。

1.2.3.4 pH對蛋白質水解過程的影響 分別稱取200 g河蜆漿,放入5個500 mL燒杯中,加適量的蒸餾水將其配制成蛋白質含量為2%的河蜆勻漿懸液,時間為3 h,溫度為50 ℃,加酶量為2.5%,pH分別設定為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。以0.5 mol/L的氫氧化鈉和0.5 mol/L的鹽酸來調節體系的pH。

1.2.3.5 底物濃度對蛋白質水解過程的影響 分別稱取200 g河蜆漿,放入5個500 mL燒杯中,加適量的蒸餾水將其配制成底物蛋白質含量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的河蜆勻漿懸液,時間為3 h,溫度為50 ℃,加酶量為2.5%,pH為8.5。

1.2.4 正交實驗設計 在單因素的基礎上以反應溫度、加酶量、pH與底物濃度為實驗因素,以TCA-SN為指標,進行了L9(34)正交實驗,因素水平如表2。

表2 正交實驗方案設計表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 河蜆多肽的制備 稱取2500 g河蜆漿于酶反應器中,按上述正交實驗優化所得最佳水解條件進行水解,水解完畢后進行滅酶、冷卻,5000 r/min離心取上清液濃縮、冷凍干燥既得河蜆粗多肽。為了將水解液中的河蜆多糖和多肽分離,得到較純的肽,選用大孔吸附樹脂對河蜆粗多肽進行分離純化。

1.2.6 大孔吸附樹脂的預處理 樹脂的預處理方法參照文獻[14]。用無水乙醇浸泡處理24 h后,再用純水洗凈,用5% HCl溶液約3～5倍體積浸泡3 h后,棄去酸液,用水洗至中性;再用5% NaOH約3～5倍體積浸泡3 h后,棄去堿液,水洗至中性,45 ℃烘干備用。

1.2.7 大孔吸附樹脂的選擇 以不同型號的大孔吸附樹脂對河蜆蛋白的吸附率不同來確定最佳吸附樹脂。分別稱取不同型號的經過預處理的樹脂各10 g,置于250 mL的錐形瓶中,用無水乙醇充分溶脹,再用去離子水沖洗干凈,瀝干水分后,各錐形瓶中均加入20 mg/mL的河蜆蛋白酶解液100 mL,置于恒溫水浴振蕩器中,設定溫度為25 ℃,震蕩速度為130 r/min,震蕩12 h使酶解液與樹脂充分接觸。震蕩完畢后靜置30 min,過濾,用凱氏定氮法測定濾液中蛋白質含量。另外,用200 mL蒸餾水沖洗干凈樹脂,濾干,加100 mL濃度為75%的乙醇,置于恒溫水浴振蕩器進行解析,解析條件為溫度為25 ℃,震蕩速度為130 r/min,震蕩12 h,震蕩完畢后靜置30 min,過濾,測上清液中蛋白質含量。計算出不同型號樹脂對河蜆蛋白的吸附率和吸附量[15],計算公式見式(3)～式(6)。

式(3)

式(4)

式(5)

式(6)

式中:qe為吸附容量(mg/g);E為吸附率(%);D為解析率(%);qd為解析量(mg/g);C0為初始蛋白質濃度(mg/mL);C1為達到吸附平衡時的蛋白質濃度(mg/mL);C2為解析液中蛋白質濃度(mg/mL);V1為酶解液的體積(mL);V2解析液的體積(mL);W為干樹脂的重量。

1.2.8 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態吸附

1.2.8.1 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態吸附動力學 分別稱取20 g干樹脂置于250 mL的錐形瓶中,再加入200 mL濃度分別為10、20、30 mg/mL的酶解液,置于25 ℃震蕩速度為130 r/min的恒溫水浴振蕩器中,每間隔一定的時間取10 mL上清液測蛋白質含量并計算其吸附容量,以吸附容量為縱坐標時間為橫坐標繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.8.2 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態解析實驗 將大孔吸附樹脂DA201-C置于濃度為30 mg/mL的蛋白溶液中吸附平衡,取10 g放入250 mL錐形瓶中,分別加入100 mL蒸餾水以及35%、55%、75%、95%的乙醇溶液于25 ℃恒溫震蕩水浴鍋中解析12 h,震蕩條件設定為130 r/min。解析完成后取10 mL解析液,以凱氏定氮法測定其蛋白質含量,并計算蒸餾水和不同濃度的乙醇溶液對河蜆蛋白的解析率。

1.2.9 大孔吸附樹脂DA201-C的動態吸附和解析實驗

1.2.9.1 不同流速對大孔吸附樹脂DA201-C吸附性能的影響 取90 g經預處理的大孔吸附樹脂DA201-C充分溶脹后,裝入2.5 cm×60 cm的層析柱中,將30 mg/mL的河蜆蛋白酶解液分別以0.5、1.0、2.0 BV/h的流速流經層析柱,檢測流出液的A220 nm處的吸收值,以A220 nm=0.05為穿透點,得到不同流速的河蜆蛋白酶解液達到穿透點時的通液量。

1.2.9.2 不同樣品濃度對大孔吸附樹脂DA201-C吸附性能的影響 將濃度分別為10、20、30 mg/mL的河蜆蛋白酶解液以1 BV/h的流速分別流經層析柱,層析柱及大孔吸附樹脂的填充量同3.2.9.1,檢測流出液的A220 nm處的吸收值,以A220 nm=0.05為穿透點,得到不同濃度的河蜆蛋白酶解液達到穿透點時的通液量。

1.2.9.3 大孔吸附樹脂DA201-C的動態解析 將30 mg/mL的河蜆蛋白酶解液以1 BV/h的流速流經層析柱,檢測流出液A220 nm處的吸收值,達到穿透點后停止上樣,以去離子水清洗至其電導率與去離子水相當,用75%的乙醇溶液以0.5 BV/h的流速流經層析柱,以A220 nm處的吸收值為指標,繪制河蜆蛋白酶解液的動態解析曲線。收集乙醇洗脫液,在45 ℃下進行旋轉蒸發,經冷凍干燥得到河蜆蛋白肽粉。

1.2.10 紫外掃描 取大孔吸附樹脂吸附前后的河蜆多肽溶液,用紫外可見分光光度計進行掃描,掃描波長200～400 nm。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對河蜆蛋白水解度的影響

不同水解酶對河蜆蛋白水解度的影響如圖1所示,四種蛋白酶對河蜆蛋白的水解隨著時間的延長,TCA-SN(%)指數都不斷增大。在水解初期,四種蛋白酶對河蜆蛋白的水解度都增加的比較快,堿性蛋白酶Alcalase在水解初期水解度增加的最為迅速,水解1 h后,水解度曲線緩慢上升。水解3 h后,堿性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶Papain、中性蛋白酶Neutrase、復合蛋白酶Protamex對河蜆蛋白酶解的TCA-SN(%)指數分別為26.84%、23.56%、23.4%和21.13%,堿性蛋白酶Alcalase明顯高于其他蛋白酶的酶解效果。堿性蛋白酶Alcalase是一種非特異性內切酶,作用位點多[16],具有很強的耐堿、耐熱性。綜合考慮,選擇堿性蛋白酶Alcalase進行酶解工藝的研究。

圖1 不同蛋白酶水解河蜆蛋白的多肽含量曲線Fig.1 Curve of TCA-SN in process of different proteinase hydrolysis Corbicula Fluminea protein

2.2 Alcalase堿性蛋白酶對河蜆蛋白水解的單因素結果

2.2.1 酶解時間對河蜆蛋白水解度的影響 從圖2可以看出,隨著酶解時間的延長TCA-SN指數不斷增大,在反應時間在0.5 h之內增幅較大,當時間超過0.5 h之后,TAC-SN增大幅度趨于平穩,當酶解時間超過3 h后,TCA-SN指數并無顯著性變化,而隨著時間的延長,河蜆蛋白蛋白水解程度越大,產生的多肽會被進一步水解,從而導致多肽減少游離氨基酸的含量增加[17],延長酶解時間同時也會延長生產周期,增大經濟成本,不利于生產,從獲取較多多肽組分和節省能耗方面來考慮,選擇控制反應的最佳時間為3 h。

圖2 酶解時間對酶解產物中多肽含量的影響Fig.2 TCA-SN of protein hydrolyzed by Alcalase with different time

2.2.2 酶解溫度對河蜆蛋白水解度的影響 酶的最適溫度會因為體系的不同而有所差異,圖3為不同溫度下堿性蛋白酶對河蜆蛋白水解效果的影響結果。從圖中可以看出,當溫度低于50 ℃時,蛋白水解的TCA-SN指數隨著溫度的升高而增大,但溫度大于50 ℃之后,隨著溫度上升,TCA-SN指數呈下降趨勢。這可能是由于溫度低于50 ℃時,酶促反應可以被視為一般的化學反應,反應速率的增大與溫度的升高呈正相關,酶活也會隨著溫度的升高而增大,溫度和酶活兩個因素共同促進反應速率的增大;但當溫度超過50 ℃后,隨著溫度的繼續上升,參加反應的堿性蛋白酶Alcalase受熱會有一定程度的變性,溫度上升引起的增加反應速率的程度不及酶失活導致的反應速率的下降的程度,導致酶促反應速率總體來說呈下降趨勢[18]。在50 ℃時,TCA-SN指數達到最大值26.96%。所以選定50 ℃為堿性蛋白酶Alcalase酶解河蜆蛋白的最佳溫度。

圖3 不同溫度對酶解產物中多肽含量的影響Fig.3 Effect of different temperature on TCA-SN in process of Alcalase hydrolysis

2.2.3 加酶量對河蜆蛋白水解度的影響 圖4為不同加酶量對河蜆蛋白水解進程的影響結果,由圖可知堿性蛋白酶Alcalase對河蜆蛋白的水解隨著加酶量的增加呈現先增大后穩定的趨勢,當加酶量為2.5%時,TCA-SN指數達到最高28.27%,此時酶濃度達到飽和,再增加酶量,TCA-SN指數無顯著變化,這可能是因為在一定底物濃度下隨著加酶量的增大,酶與底物接觸機會增多,所以反應速度會隨著酶添加量的增大而增大;當加酶量達到一定值時,酶與底物結合達到飽和,再增加酶也不能與底物結合,故反應速度幾乎沒有變化,而酶量的增大會帶來很大的經濟成本,所以選定2.5%為最適加酶量。

圖4 不同加酶量對酶解產物中多肽含量的影響Fig.4 DH of Alcalase at different enzyme dosage

2.2.4 pH對河蜆蛋白水解度的影響 不同pH下堿性蛋白酶Alcalase對河蜆蛋白水解效果的影響如圖5所示,pH<8.5時,水解程度與pH呈正相關,這可能是由于pH<8.5時,河蜆蛋白的構象趨于展開,酶切位點充分暴露,有利于蛋白酶與河蜆蛋白充分結合,所以酶促反應速率逐漸升高;當pH為8.5時,TCA-SN指數達到最大值為28.97%;當pH>8.5后,TCA-SN指數有所下降但仍高于pH<8.5時,這可能是由于堿性過高影響了蛋白酶的活性。因此,堿性蛋白酶水解河蜆蛋白的最佳pH為8.5。

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

圖5 不同pH對酶解產物多肽含量的影響Fig.5 Effect of different pH on TCA-SN in process of Alcalase hydrolysis

2.2.5 底物濃度對河蜆蛋白水解度的影響 不同底物濃度下堿性蛋白酶Alcalase對河蜆蛋白水解效果的影響如圖6所示,隨著酶與底物比的增加,TCA-SN呈現增加趨勢;當底物濃度為1.5%時,TCA-SN達到最大值為25.70%;而當底物濃度大于1.5%時,酶與底物比超過一定值,TCA-SN有所降低。這可能是由于在酶濃度一定的條件下,當底物濃度較低時,反應速度與底物濃度呈正相關;然而隨著底物濃度的不斷增加,酶與底物的結合位點達到飽和,此時再增加底物濃度就會增加酶與蛋白特殊位點結合的空間位阻,從而導致酶促反應速度反而下降。因此,選擇最適底物濃度為1.5%。

圖6 不同底物濃度對多肽含量的影響Fig.6 Effect of different concentration of substrate on the TCA-SN

2.3 堿性蛋白酶Alcalase對河蜆蛋白水解的正交實驗

表3為堿性蛋白酶水解河蜆蛋白的正交實驗表,由表3可知,在水解時間為3 h的前提下,以TCA-SN指數為考核指標,影響實驗結果的主次因素為A>C>D>B,最優組合為A3B3C2D3。即水解溫度55 ℃,加酶量3%,底物濃度2%,起始pH為8.5。在此條件下做驗證實驗,結果表明酸溶性多肽含量為29.65%,高于正交實驗所列出的任何一組,所以選用這個組合條件為最佳條件。

2.4 不同大孔吸附樹脂對河蜆多肽靜態吸附和解析性能比較

大孔吸附樹脂對河蜆多肽的吸附情況與樹脂的物理化學性質密切相關,根據樹脂的結構和極性等參數來選著合適的大孔吸附樹脂,例如孔隙直徑、孔隙體積和比表面積等[19]。根據相似相溶的原則,非極性或極性弱的樹脂對河蜆多肽具有更好的吸附性能,幾種不同樹脂多河蜆多肽的吸附及解析性能如圖7所示,大孔吸附樹脂DA201-C對河蜆多肽的吸附率為61.12%,明顯高于其它樹脂;而大孔吸附樹脂DA201-M和DA201-D的的解析率都很高,分別為82.70%和82.36%,但是它們的吸附率卻很低,分別為25.19%和35.83%,過低的吸附率和吸附容量限制了它們的使用。通過比較可知,大孔吸附樹脂DA201-C具有相對較好的吸附和解析性能,故選擇DA201-C為最佳吸附樹脂。

圖7 不同大孔吸附樹脂的吸附與解析性能Fig.7 Adsorption/desorption capacities and ratio of different resins

2.5 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態吸附與解析實驗

2.5.1 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態吸附動力學 大孔吸附樹脂DA201-C對不同濃度河蜆多肽的靜態吸附動力學曲線如圖8所示,在吸附的前2 h,吸附容量增加較快,尤其在1 h之內,吸附容量增加的非常迅速,3 h后吸附容量趨于平衡,這說明此時大孔吸附樹脂DA201-C對河蜆多肽的吸附已達到動態平衡。由圖可知,大孔吸附樹脂吸附達到平衡時的吸附容量與河蜆多肽的初始濃度具有很大相關性,濃度越大達到平衡時的吸附量就越大。

圖8 大孔吸附樹脂DA201-C對河蜆多肽的靜態吸附曲線Fig.8 Static dynamics curve of DA201-C MAR adsorbed Corbicula Fluminea peptide

2.5.2 大孔吸附樹脂DA201-C的靜態解析實驗 在大孔吸附樹脂吸附解析分離過程中,乙醇安全無毒是最常用的解析劑。不同體積分數的乙醇溶液對DA201-C大孔吸附脂吸附分離河蜆多肽的洗脫性能如圖9所示,隨著乙醇濃度的增大,解析率會不斷增大,當乙醇濃度為75%時對河蜆多肽解析率最高,解吸效果最好,解析率達最大值為72.82%,乙醇體積分數過高,脫附效果會下降,這可能是因為多肽在高濃度乙醇中溶解度降低[20]。

圖9 不同乙醇濃度對河蜆多肽的靜態解析曲線Fig.9 Effect of different eluent desorption to Corbicula Fluminea Peptide

2.6 大孔吸附樹脂DA201-C的動態吸附和動態解析

2.6.1 不同上樣流速對大孔吸附樹脂DA201-C吸附性能的影響 大孔吸附樹脂的吸附過程大致可以分為三個階段:吸附質在樹脂表面的薄液層(液膜)中擴散;孔內擴散和表面擴散;吸附質吸附在大孔樹脂細孔內的吸附位上。大孔樹脂對河蜆多肽的吸附速度由這三個基本階段的速度控制:河蜆多肽在吸附劑粒子表面液膜中的擴散速度;粒子內的擴散速度;粒子內細孔表面的吸附速度。一定時間后,吸附達到一個動態平衡[21]。過快的上樣速度會使多肽溶液沒有完成三個階段的吸附就流出層析柱,而過慢的上樣速度又會使分離效率降低。如圖10所示,隨著上樣速度的加快,到達穿透點時的通液量逐漸減少,流速為2 BV/h時,到達穿透點的通液量最少為40 mL,流速為1 BV/h和0.5 BV/h時到達穿透點的通液量分別為84.14 mL和90 mL。綜合考慮,選擇1 BV/h為最佳上樣流速。

圖10 不同上樣流速時河蜆多肽的穿透曲線Fig.10 Brokethrough pattern of different flow rate

2.6.2 不同樣品濃度對大孔吸附樹脂DA201-C吸附性能的影響 不同濃度河蜆多肽的穿透曲線如圖11所示,隨著上樣濃度的增大,達到穿透點時的通液量不斷減少,而由表4可知,河蜆多肽濃度越高,大孔吸附樹脂的動態吸附量就越大,動態吸附一般是在不超過大孔吸附樹脂吸附容量的情況下選擇較大的濃度上樣。當河蜆多肽濃度為30 mg/mL時,穿透體積為90.08 mL,此時的動態吸附量為2702.40 mg,故綜合考慮動態吸附量與平衡時間,本實驗選擇30 mg/mL濃度上樣。

圖11 不同上樣濃度時河蜆多肽的穿透曲線Fig.11 Brokethrough volumes of different flow rate Corbicula Fluminea peptide

表4 不同上樣濃度對樹脂動態吸附量的影響Table 4 Effect of different concentrations on adsorption of macroporous resin

2.6.3 大孔吸附樹脂DA201-C的動態解析 圖12為用75%的乙醇進行解析時的動態解析曲線,上樣流速為0.5 BV/h,隨著洗脫液體積的增大,流出液在220 nm處的吸光值先增大后減小,當洗脫液體積達到1800 mL時,停止洗脫,收集洗脫液于45 ℃減壓濃縮,冷凍干燥,即可得到河蜆多肽。河蜆多肽的回收率為82.19%,純度較高。故大孔吸附樹脂DA201-C對河蜆多肽具有很好的分離效果。

圖12 大孔吸附樹脂DA201-C的動態解析曲線Fig.12 Dynamic desorbed of Corbicula Fluminea Peptide to DA201-C MAR

2.7 河蜆多肽吸附前后的紫外掃描圖譜

河蜆多肽吸附前后的紫外掃描圖譜如圖13所示,河蜆多肽在吸附前有兩個特征吸收峰分別在200～240 nm和250～300 nm附近,這兩個特征吸收峰分別代表多肽和疏水性氨基酸。而多肽溶液經大孔吸附樹脂吸附后其200～240 nm和250～300 nm附近的特征吸收峰變小了,說明大孔吸附樹脂DA201-C主要吸附肽和氨基酸,特別是疏水性氨基酸。

圖13 大孔吸附樹脂DA201-C對河蜆多肽吸附前后的紫外掃描圖譜Fig.13 UV canning pattern of Corbicula Fluminea peptide solution before and after adsorption

3 結論

比較不同蛋白酶對河蜆蛋白的水解效果,確定堿性蛋白酶Alcalase為最佳水解用酶,通過正交實驗優化法確定了最佳水解工藝條件為:水解溫度55 ℃,加酶量3%,底物濃度2%,起始pH8.5,水解時間為3 h,在此條件下TCA-SN的含量為29.65%。

比較不同大孔吸附樹脂對河蜆多肽的吸附性能,確定DA201-C為最佳吸附樹脂,其最佳吸附條件為:上樣流速1 BV/h,上樣濃度30 mg/mL,乙醇洗脫濃度為75%,在此條件下河蜆多肽的回收率為82.19%。

[1]劉晶晶,徐云婕,韓曜平,等. 洪澤湖野生河蜆營養成分的分析與評價[J]. 食品工業科技,2014,35(15):360-364.

[2]趙謀明,任嬌艷. 食源性生物活性肽結構特征與生理活性的研究現狀與趨勢. 中國食品學報,2011. 11(9):69-81.

[3]Klompong V,Benjakul S,D antachote,et al. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally(Selaroidesleptolepis)as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type[J]. Food Chemistry,2007,102:1317-1327.

[4]趙樹民,鮑勇剛,石松傳. 一種酶解蝌蚪提取多肽的方法及其制備得到的多肽:,CN105420331A[P]. 2016.

[5]杜云建,趙玉巧,李念念. 酶解法制備草魚魚鱗多肽及其清除羥自由基的研究[J]. 食品科學,2010,31(7):168-172.

[6]鄧尚貴,楊燊,秦小明. 低值魚蛋白多肽-鐵(Ⅱ)螯合物的酶解制備及其抗氧化、抗菌活性[J]. 廣東海洋大學學報,2006,26(4):54-58.

[7]Nesse K O,Nagalakshmi A P,Marimuthup,et al. Efficacy of a fish protein hydrolysate in mal-nourished children[J]. Indian Journal of Clinical Bio-chemistry,2011,26(4):360-365.

[8]劉恩岐. 黑豆蛋白酶解產物的生物活性研究與結構表征[D]. 陜西:西北農林科技大學,2013.

[9]諾維信蛋白酶說明書,2012版. 丹麥諾維信有限公司.

[10]陳輝,杜進民,李雪梅. 大豆多肽的功能特性及加工工藝[J]. 糧油食品科技,2000,(01):88-91.

[12]Nilsang S,Lertsiri S,Suphantharika,M. et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases. J. Food Eng. 2005.70,571-578.

[13]陳智慧,史梅,王秋香,等. 用凱氏定氮法測定食品中的蛋白質含量[J]. 新疆畜牧業,2008(5):22-24.

[14]Choi Y J,Hur S,Choi B D,et al. Enzymatic hydrolysis of recovered protein from frozen small croaker and functional properties of its hydrolysates[J]. Journal of food Science,2009,74(1):17-24.

[15]王黎明,夏文水. 水法提取茶多糖工藝條件優化[J]. 食品科學,2005,26(5):171-174.

[16]Xu,R.H.,Cheng,N. Effects of the processing steps on parathion levels duringhoney production and parathion removal by macroporous adsorption resins. Food Control. 2012，23,234-237.

[17]施雪,孔保華,劉騫. 酶水解制備鯉魚肉蛋白抗氧化肽[J]. 東北農業大學學報,2011,11:32-39.

[18]方細娟,曾慶祝,許慶陵. 羅非魚肉水解蛋白Alcalase酶解工藝優化[J]. 食品研究與開發,2013,12:46-52.

[19]李勇,黃先智,闞建全. 大孔吸附樹脂吸附分離蠶蛹ACE抑制肽的研究[J]. 食品工業科技,2012,33(16):281-284.

[20]趙利,王璋,許時嬰. 大孔吸附樹脂對酪蛋白非磷肽吸附性的研究[J]. 食品工業科技,2002,23(12):28-31.

[21]周英新. 基于黃酮類分子構型的大孔吸附樹脂吸附動力學模型研究[D]. 北京:北京中醫藥大學,2012.

Preparation technology of polypeptide fromCorbiculafluminea

ZHAO Qi1,DU Yu-qian2,YANG Yu-luan1,CHEN Li-li1,YUAN Mei-lan1,ZHAO Li1，*

(1.National R&D Branch Center for Freshwater Fish Processing,College of Life Science,Jiangxi Science and Technology Normal University,Nanchang 330013,China;2.Nanchang Food and Cosmetic Authority,Nanchang 330038,China)

In this paper,with trichloroacetic acid-soluble nitrogen(TCA-SN)as indicators,the effect of several different enzymes including Neutrase,Protamex,Alcalase,Papain for protein hydrolysis were compared. Hydrolysis temperature,hydrolysis time,the dosage of enzyme,pH,the substrate concentration were as influencing factors. The results indicated that Alcalase was the best hydrolytic enzymes. The hydrolysis parameters was defined by the orthogonal test. The results showed that the optimum conditions were temperature of 55 ℃,the dosage of enzyme of 3%,the substrate protein concentration of 2%,the pH8.5,time of 3 h,and the TCA-SN was 26.95%. The adsorption capacity of several different macroporous adsorption resins(MAR)forCorbiculaflumineapeptides were investigated. The DA201-C MAR had the optimum adsorption property forCorbiculaflumineapeptides. The best condition was feeding amount of 1 BV/h,feeding concentration of 30 mg/mL,ethanol elution volume fraction of 75%,eluent were decompressed enrichment and freeze-drying,the percentage composition of peptides was 82.19%.

Corbiculafluminea;hydrolysis;macroporous adsorption resins;separation;polypeptides

2016-07-26

趙琪(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學，E-mail：zhaoqish@126.com。

*通訊作者:趙利(1967-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學，E-mail：lizhao618@hotmail.com。

江西省科技廳發明專利產業化技術示范項目(20143BBM26108)；江西省教育廳科技重點項目(GJJ12582)；江西省科技廳科技支撐重大項目(20152ACF60008)。

TS254.1

B

:1002-0306(2017)03-0227-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.035