雙水相體系萃取藍莓多糖的分配平衡研究

馬新輝,李镕廷,趙曉涵,舒 楊,高 健,陳 健,曹獻英

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

雙水相體系萃取藍莓多糖的分配平衡研究

馬新輝,李镕廷,趙曉涵,舒 楊,高 健,陳 健*,曹獻英*

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

采用超聲水提法提取藍莓多糖,再用雙水相法進行純化。以藥液百分數(shù)、K2HPO4濃度、PEG6000濃度為單因素,以下相多糖的萃取率為指標,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓多糖的雙水相萃取工藝。結(jié)果表明,當藥液百分數(shù)60%,PEG6000 16%,K2HPO416.9%,下相藍莓多糖得率最高,可達95.03%;且多糖純度明顯高于傳統(tǒng)的水提醇沉法。所得到模型高度顯著(R2=0.9920),擬合性好,可用于藍莓多糖的萃取。

藍莓多糖,雙水相體系,響應(yīng)面,萃取

藍莓富含花色苷[1]、多糖[2]、脂肪、微量元素等。其中,花色苷因其獨特的生理活性廣被研究[3-6]。研究表明[7],脫去花色苷的藍莓殘渣中的多糖含量與藍莓果中多糖含量相差不大。藍莓多糖具有抗氧化[8]、抑菌[9]、抗疲勞[10]等功能,應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)分離多糖的工藝已有報道[11-13]。目前,傳統(tǒng)的提取多糖的方法是水提醇沉法。此方法操作繁瑣、試劑損耗大。

雙水相萃取是一種新型的分離技術(shù),它具有以下優(yōu)點:反應(yīng)條件溫和,能有效保證提取物質(zhì)的活性;有機溶劑用量較少,生物相容性好;操作時間短,提取效率高等。目前,雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于酚酸[14]、蛋白質(zhì)[15]、抗生素[16]、多糖[17-18]的提取分離。李化等[19]人將響應(yīng)面法用于雙水相萃取五味子多糖,得出雙水相萃取可以用于五味子多糖的提取。目前,國內(nèi)還未見雙水相萃取藍莓多糖的工藝報道。

為此,本研究采用PEG6000和K2HPO4雙水相體系,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取了對提取率影響較為顯著的3個因素,進行(BBD)響應(yīng)面法優(yōu)選出藍莓多糖的最佳提取條件,以期為開發(fā)高效率藍莓粗多糖提取新方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藍莓殘渣:取藍莓(品種為愛國者)打漿,按料液比1∶20加入0.5%三氟乙酸的甲醇溶液,4 ℃下靜置24 h,離心后收集殘渣干燥即為藍莓殘渣。聚乙二醇6000(PEG6000)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、苯酚、濃硫酸國產(chǎn)分析純 海南衡橋科技有限公司。

酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;電子天平 廈門群隆儀器有限公司;超聲清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;TG22-WS離心機 長沙湘銳離心機有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓多糖提取液的制備 取藍莓殘渣5.0 g,精密稱定,置于250 mL錐形瓶,加入蒸餾水200 mL,超聲40 min,過濾,濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,定容。

1.2.2 雙水相體系的配制 精密稱取藍莓多糖提取液5 mL,置于15 mL離心管中,加入PEG6000 1.5 g,K2HPO41.0 g,加蒸餾水至10 mL,搖勻至PEG6000和K2HPO4完全溶解。4000 r/min離心15 min。分相后記錄上下相的體積。精密稱取上相1 mL于10 mL容量瓶中,精密稱取下相1 mL于25 mL容量瓶中,分別定容,用于上相和下相中藍莓多糖的定量分析。

1.2.3 多糖含量的測定 以葡萄糖為對照,采用苯酚-硫酸法[7]測定多糖的含量。回歸方程為:y=6.8369x+0.0897,R2=0.9990。分別精密吸取上下相樣品稀釋液1 mL于燒杯中,加入5%的苯酚溶液1.6 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸溶液7.0 mL,靜置30 min,取出,于490 nm處測吸光值。按照公式(1)～式(3)計算分配系數(shù)、相比和多糖在下相中的萃取率。

式(1);

式(2);

式(3)

K為多糖在雙水相體系的分配系數(shù);R為雙水相體系上下相的體積比;Y為多糖在下相中的萃取率,%;Vt為雙水相體系上相體積,mL;Vb為雙水相體系下相體積,mL;Ct為雙水相體系上相多糖的質(zhì)量濃度,g/L;Cb為雙水相體系下相多糖的質(zhì)量濃度,g/L。

1.2.4 雙水相體系的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗設(shè)計 設(shè)定PEG6000濃度、K2HPO4濃度、藥液百分數(shù)為因素,以下相多糖萃取率為指標,考察三因素對藍莓多糖萃取效果的影響。固定PEG6000濃度為20%,K2HPO4濃度10%,分別考察30%、40%、50%、60%、70%的提取液對藍莓多糖萃取效果的影響;固定藥液量50%,K2HPO4濃度為15%,分別考察5%、10%、15%、20%、25%PEG6000濃度對藍莓多糖萃取效果的影響;固定藥液百分數(shù)為50%,PEG6000濃度20%,分別考察10%、15%、20%、25%、30% K2HPO4濃度對藍莓多糖萃取效果的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取藥液百分量、PEG6000濃度、K2HPO4濃度作為考察因素,以下相多糖的萃取率為響應(yīng)值,采用三因素三水平對藍莓多糖的萃取進行響應(yīng)面分析(表1)。

1.2.5 紫外檢測 雙水相萃取的多糖經(jīng)透析濃縮,配成1 mg/mL的多糖液,以蒸餾水為對照,200～400 nm全波段掃描[20],檢測是否有核酸蛋白質(zhì)的特征吸收峰。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Design-Expert V7.0軟件進行三因素三水平的Box-Behnken實驗設(shè)計。所有實驗重復(fù)三次,使用SPSS 19.0 進行方差分析。

表1 Box-Behnken實驗因素水平表Table 1 Box-Behnken experimental for factor and level

2 結(jié)果和分析

2.1 雙水相體系對多糖萃取率的影響

2.1.1 藥液百分數(shù)對下相多糖萃取率的影響 固定PEG6000濃度和K2HPO4濃度,藥液百分數(shù)對藍莓下相多糖萃取率的影響效果見圖1。由圖1可知,在一定的范圍內(nèi),隨著藥液百分數(shù)的增加,下相中的藍莓多糖萃取率升高,藥液百分數(shù)增加至50%時萃取率最大。因此,藥液百分數(shù)以50%為宜。

圖1 藥液量對提取率的影響Fig.1 Effect of dosage on extraction rate

2.1.2 PEG6000濃度對下相多糖的萃取率的影響 固定藥液百分數(shù)和K2HPO4濃度,PEG6000濃度對藍莓下相多糖萃取率的影響效果見圖2。由圖2可知,在一定的范圍內(nèi),隨著PEG6000濃度的增加,下相中的藍莓多糖萃取率升高,PEG6000增加至20%時萃取率最大。因此,PEG6000以20%為宜。

圖2 PEG6000對萃取率的影響Fig.2 Effect of PEG6000 on extraction rate

2.1.3 K2HPO4濃度對下相多糖的萃取率的影響 固定藥液百分數(shù)和PEG6000濃度,K2HPO4濃度對多糖萃取率的影響見圖3。由圖3可知,在一定范圍內(nèi),隨著K2HPO4濃度的增加,K2HPO4濃度為15%時多糖萃取率達到最高。K2HPO4濃度量繼續(xù)增加,雙水相體系中鹽濃度過高,下相中的多糖會發(fā)生鹽析作用,萃取率降低。故K2HPO4取15%較好。

圖3 磷酸二氫鉀對多糖萃取率的影響Fig.3 Effect of K2HPO4 on extraction rate

2.2 響應(yīng)面結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面因素和結(jié)果 如表2所示,共有17個實驗點,其中,12個是析因點,5個為零點。析因點是自變量所構(gòu)成的三維頂點。零點時區(qū)域中心點,設(shè)置5次是為了評估實驗誤差。

表3 模型的方差分析Table 3 ANOVA for Model Analysis of variance

表2 響應(yīng)面結(jié)果表Table 2 Response Surface Design Experimental Results

2.2.2 模型擬合和檢驗 對響應(yīng)面的結(jié)果進行多元回歸擬合,得雙水相體系下相的藍莓萃取率為Y與藥液百分數(shù)、PEG6000濃度、K2HPO4濃度的二次多項回歸方程為:Y=92.89+4.57A+13.30B+2.59C-5.28AB-6.71AC-3.28BC-2.94A2-11.30B2-5.09C2模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知,模型的F值為252.48,且p<0.0001,說明模型是可靠的;模型的決定系數(shù)為0.9920,表明只有0.8%的實驗數(shù)據(jù)不適合預(yù)測模型;模型的校正的系數(shù)為0.9930,說明擬合的模型良好,只有0.7%的實驗數(shù)據(jù)的變異性不能解釋。失擬項的p值為0.9528,不具有統(tǒng)計學差異,說明模型不需要引入更高次數(shù)的項。故此模型可以很好的解釋效應(yīng)值的變化。同樣,各因素及因素間的p<0.01,具有顯著性差異,說明選取的每個實驗因素對下相藍莓多糖的得率有顯著的影響,且每個因素對藍莓多糖得率的影響差別很大。

2.2.3 響應(yīng)面的分析及優(yōu)化 響應(yīng)面分析的圖形可以直觀地看出各自變量對響應(yīng)值的影響。根據(jù)回歸模型得到的響應(yīng)曲面見圖4～圖6。

由圖4可知,當K2HPO4濃度和PEG6000濃度一定時,隨著藥液百分數(shù)的增加(40%～60%),萃取率逐漸上升,當藥液百分數(shù)達到50%時,萃取率上升速度減緩;當藥液百分數(shù)和PEG6000濃度一定時,隨著K2HPO4濃度的增加,萃取率先增加后減小,當K2HPO4濃度為17.5%時,萃取率最大。此外,藥液百分數(shù)和K2HPO4濃度對下相藍莓多糖萃取率的交互作用顯著。

圖4 藥液百分數(shù)和磷酸氫二鉀濃度對萃取率的影響Fig.4 Response surface plot of dosage and K2HPO4 on extraction rate

由圖5可知,當藥液百分數(shù)和K2HPO4濃度一定(較高)時,隨著PEG6000濃度的增加,萃取率先增加后減少,在PEG6000濃度18%左右時萃取率最高,對多糖萃取率的影響極顯著。

圖5 藥液百分數(shù)和PEG6000濃度對萃取率的影響Fig.5 Response surface plot of PEG6000 and dosage on extraction rate

由圖6可知,當藥液百分數(shù)和PEG6000濃度一定時,隨著K2HPO4濃度的增加,萃取率先增加后減少,在18%附近時萃取率達到最大值。

圖6 PEG6000濃度和磷酸氫二鉀濃度對萃取率的影響Fig.6 Response surface plot of PEG6000 and K2HPO4 on extraction rate

從圖4～圖6綜合可以看出,藥液百分數(shù)、PEG6000濃度、K2HPO4濃度、三因素兩兩之間的交互作用及其明顯,且A、C的交互作用最為顯著。這與方差分析的結(jié)果保持一致。軟件分析得出最佳的萃取工藝為:藥液百分數(shù)為60%,K2HPO4濃度為16.9%,PEG6000濃度為16%,萃取率最高為96.97%。實際測得的平均萃取率為95.03%,相對誤差較小。因此,得出的萃取工藝具有很好的預(yù)測性。

2.2.4 紫外掃描結(jié)果 研究表明,蛋白質(zhì)和核酸分別在260、280 nm處有特征吸收峰。圖7為不同方法制備多糖的紫外掃描結(jié)果。從圖7可以看出,雙水相萃取的藍莓多糖在260、280 nm處無特征吸收峰,而傳統(tǒng)醇沉法在280 nm處有特征吸收峰。相比醇沉法,雙水相體系具有良好的除蛋白效果。

圖7 紫外掃描結(jié)果Fig.7 UV scanning results rate

3 結(jié)論

本文采用超聲波-雙水相萃取法提取藍莓多糖,并對雙水相萃取工藝進行優(yōu)化,結(jié)合Design-Expert軟件,通過二次回歸得到萃取率和藥液量、PEG6000含量和K2HPO4含量的回歸模型,且模型的預(yù)測結(jié)果較好。萃取藍莓多糖的最佳條件為藥液百分數(shù)60%,K2HPO4濃度16.9%,PEG6000濃度為16%,平均萃取率為95.03%,與理論相比,相對誤差為2.01%;結(jié)果可靠,且除蛋白效果較好,適合藍莓多糖的萃取。

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Optimization of two-phase extraction of polysaccharide from blueberry

MA Xin-hui,LI Rong-ting,ZHAO Xiao-han,SHU Yang,GAO Jian,CHEN Jian*,CAO Xian-ying*

(Department of food college,Hai Nan University,Haikou 570228,China)

The polysaccharide was extracted by ultrasonic water extraction,then purified by aqueous two phase. With the percentage of solution,the concentration of K2HPO4and the concentration of PEG6000 as the single factor,and extraction rate of polysaccharides from the lower phase as the index,the double phase extraction technology of blueberry polysaccharide was optimized by response surface methodology. The results showed that the percentage of liquid medicine 60%,PEG6000 16%,K2HPO416.9%,the next phase of blueberry polysaccharide yield was the highest,up to 95.03%.And the purity of polysaccharide was significantly higher than that of the traditional water extraction and alcohol precipitation method. The model was highly significant(R2=0.9920),good fitting,can be used for extraction of polysaccharides from blueberry.

polysaccharides of blueberries;aqueous two-phase;rseponse surface methodology;extraction

2016-07-12

馬新輝(1993-),男,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:15993613885@163.com。

*通訊作者:陳健(1985-),男,博士,講師,研究方向:天然產(chǎn)物的加工與利用,E-mail:chenjian19850702@163.com。 曹獻英(1962-),女,博士,教授,研究方向:食品質(zhì)量與安全,E-mail:cxying_02@163.com。

國家自然科學基金項目:微流控芯片技術(shù)制備花青素微乳的機制研究(31501497)。

TS255.4

B

:1002-0306(2017)03-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.032