田口設計優化解脂耶羅維亞酵母產油發酵培養基

夏乾竣,王月皎,王 飛,李 迅

(南京林業大學江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,南京林業大學化學工程學院,江蘇南京 210037)

田口設計優化解脂耶羅維亞酵母產油發酵培養基

夏乾竣,王月皎,王 飛,李 迅*

(南京林業大學江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,南京林業大學化學工程學院,江蘇南京 210037)

本研究以粗甘油為碳源通過田口設計對解脂耶羅維亞酵母產油脂的培養基進行優化。首先通過單因素實驗得到對結果影響最顯著的因素,在單因素實驗的基礎上利用Minitab 17設計田口式正交實驗,對實驗中各因素水平的均值和信噪比進行分析。結果表明培養基中的C/N和MgSO4·7H2O的濃度對油脂產量有極顯著影響,CaCl2的濃度有顯著影響。最佳培養基組成為C/N為100∶1(粗甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L。使用最佳培養基配方在28 ℃ 180 r/min條件下培養4 d,油脂產量達到1.859 g/L,與田口設計的預測結果1.782 g/L接近,相對于未優化時油脂產量提高了48.5%。

解脂耶羅維亞酵母,微生物油脂,發酵條件優化,Minitab,田口設計

解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)作為產油酵母能利用糖、甘油、地溝油等多種碳源來生產單細胞油脂[1-4]。油脂中的脂肪酸成分主要為棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸,其中約一半為油酸,少部分為亞油酸[5]。油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸在人和動物的新陳代謝中起著重要的作用,具有降低生物體脂肪、抑制腫瘤、抗動脈粥樣硬化等生理功能[6]。人體無法合成亞油酸等不飽和脂肪酸來保證機體的正常運轉,要從食物中攝入[7]。解脂耶羅維亞酵母是為數不多的通過美國FDA和GRAS認證的真菌,可以應用到食品和醫藥生產等眾多領域[8-9],因此解脂耶羅維亞酵母為原料生產保健品或者動物飼料具有極高的應用前景。目前國內外主要以葡萄糖作為碳源進行解脂耶羅維亞酵母的發酵產油,對通過代謝工程改造后的菌株油脂產量最高能達到15 g/L[10-11]。本研究是以生物柴油的副產物甘油作為酵母生長的碳源,優化發酵條件生產單細胞油脂。

穩健參數設計(Robust Parameter Design)也稱田口設計,是由于日本田口玄一(Genichi Taguchi)博士在參數設計方面的杰出貢獻,他引進了S/N(信噪比)的概念,并以此作為評價參數組合優劣的一種測度[12]。其基本思想是將穩定性設計到產品的制造過程中去,以信噪比作為穩定性的指標,從而找到最優的設計方案[13-14]。目前,Minitab和JMP是業界最主流的兩款六西格瑪統計分析軟件,均能實現田口設計,其中Minitab軟件是世界上應用最廣的統計軟件之一,其功能強大且操作簡單。本研究使用Minitab軟件設計田口式正交實驗,以解脂耶羅維亞酵母為發酵菌株,以廉價的甘油為碳源優化發酵條件,實現其胞內油脂的高效生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型Yarrowialipolytica2.2087 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;酵母提取物,蛋白胨 購自英國Oxoid公司；粗甘油 來自于常州強林生物質能源材料有限公司;甘油含量為89.7%,灰分為0.3%,其余為水。地溝油 來自于常州悅達卡特新能源有限公司主要成分為飽和甘油三酯和飽和游離脂肪酸。其他生化試劑及藥品均為國產分析純。

志誠:RS-232恒溫搖床 日本Hirayama:HVA-85滅菌鍋 南京稼竣生物科技有限公司:A502200可視氮吹儀 南京恒裕儀器:生化培養箱SP-300B 瑞士梅特勒-托利多:AL104電子分析天平 蘇凈集團安泰公司:VS-1300L-U超凈臺 上海精宏實驗設備有限公司:DHG-9123A恒溫鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的培養 將菌種粉末溶解在5 mL YPG(甘油2 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母提取物1 g/L,121 ℃滅菌20 min,固體培養基在YPG的基礎上加2%的瓊脂)培養基中,28 ℃ 180 r/min活化12 h,12 h后取活化后的菌液再次活化,以10%甘油保菌。保藏菌在 YPG固體培養基上劃線,置于28 ℃生化培養箱48 h。從固體培養基上取少許菌體,接種于5 mL YPG培養基中培養12 h。再以1%接種量接種于50 mL YPG培養基中,28 ℃ 搖床180 r/min發酵培養48 h作為種子液。按10%的接種量將種子液接種于發酵培養基(粗甘油50 g/L,(NH4)2SO41.08 g/L,KH2PO44 g/L,MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,121 ℃滅菌20 min)中,28 ℃ 180 r/min發酵培養4 d。

1.2.2 生物量的測定 將發酵液于10000 r/min離心10 min收集菌體,去離子水洗滌菌體兩次。去掉上清,菌體在85 ℃烘箱烘干至恒重,比較烘干前后兩次離心管的質量差得到菌體的干重。

1.2.3 油脂的提取 每克干菌加入4 mol/L HCl 6 mL,靜置20 min后,煮沸30 min,立即放置于-20 ℃迅速冷卻,以破壞細胞壁。加入兩倍體積的氯仿/甲醇混合溶液(體積比1∶1),充分震蕩萃取,10000 r/min離心5 min,收集氯仿層,重復萃取一次。氯仿萃取液中加入等體積質量分數0.1%的NaCl,以除去一些游離的脂肪酸。10000 r/min離心5 min,收集氯仿層,使用氮吹快速除去氯仿得到油脂,比較前后兩次離心管的質量得到油重[15],以油脂的產量作為最終的表征數據。產油率計算公式為:產油率=產油量/菌體干重

1.2.4 碳源的選擇 解脂耶羅維亞酵母能夠廣泛利用碳源進行自身的生長如:糖類、甘油、地溝油等。不同的碳源在解脂耶羅維亞酵母體內參與的代謝過程各不相同,解脂耶羅維亞酵母對不同碳源的利用能力也不同。分別選取葡萄糖、純甘油、粗甘油、地溝油作為碳源,研究不同碳源對解脂耶羅維亞酵母產油能力的影響。培養條件為碳源50 g/L,酵母提取物2 g/L,28 ℃ 180 r/min培養4 d,找出解脂耶羅維亞酵母培養的最佳碳源。

1.2.5 單因素實驗 C/N是影響菌株油脂合成的重要因素。以甘油為碳源和(NH4)2SO4為氮源,保持碳源甘油的量為50 g/L,調整C/N分別為25、50、75、100、125,(NH4)2SO4的濃度分別為4.3、2.15、1.43、1.08、0.86 g/L其它培養條件不變,分別測定最終的油脂產量。同時KH2PO4、CaCl2和MgSO4·7H2O是對細胞油脂影響最大的幾種無機鹽。在細胞分裂增殖過程中磷起著至關重要的作用,它是核酸、磷脂、ATP的重要組成,生物體在缺少磷時其自身的部分機能將無法正常運行,磷的含量直接關系到細胞的生長。鉀離子和鎂離子是許多酶的激活劑是生物體內含量最高的幾種離子,維持著細胞體的正常生物活動。鈣離子能激活α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶,使代謝向有利于油脂合成代謝的方向進行[16-17]。采用單因素實驗,考察各個因素變量對解脂耶羅維亞酵母油脂產量的影響。

1.2.6 田口設計正交實驗 在單因素實驗的基礎上,對這四個因素設計正交實驗進行分析,利用Minitab 17里的DOE實驗設計設計田口式正交實驗。選用L16(44)正交設計表配制培養基進行實驗,以產油量為響應值,正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.7 數據處理 采用Origin 8.5軟件作圖,利用Minitab 17軟件田口式正交實驗的設計及數據分析。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對解脂耶羅維亞酵母產油性能的影響

結果如圖1所示,選取葡萄糖、純甘油、粗甘油、地溝油為碳源發酵,雖然以甘油為碳源的油脂的產率和產量不是最高,低于以葡萄糖和地溝油作為碳源的油脂產率和產量。但葡萄糖成本較高,地溝油成分復雜且不穩定,而甘油作為生物柴油的副產物,產量大且利用價值低,成份較穩定,所以本實驗采用來源廣泛且價格低廉的甘油作為解脂耶羅維亞酵母發酵的碳源。以粗甘油為碳源,油脂產率為29.1%,油脂產量為1.252 g/L。

圖1 碳源對產油的影響Fig.1 Effect of carbon source on oil production

2.2 不同碳氮比對解脂耶羅維亞酵母產油性能的影響

酵母的生長一般分為菌體的增殖期和油脂的累積期[18]。當培養基中營養充足時主要來進行菌體的增殖,當氮源消耗殆盡且碳源充足時,則進入油脂的累積期[19]。

由圖2可知,當C/N過低時,培養基內養分充足,菌體主要進行自身的增殖,油脂累積期時間較短,油脂含量較低,菌體重量較大。隨著碳氮比的增加,培養基內氮源逐漸減少,菌體的重量下降,當氮源消耗殆盡菌體進入油脂累積期,產油量上升。當C/N為50時,終得到的油脂含量最高,達1.282 g/L。

圖2 碳氮比對產油的影響Fig.2 Effect of C/N Ratio on oil production

2.3 無機鹽對解脂耶羅維亞酵母產油性能的影響

由圖3所示,當培養基中加入CaCl2、MgSO4·7H2O和KH2PO4的濃度分別為0.1、3、4 g/L時,酵母的產油量有顯著的上升。其中CaCl2的效果最佳,加入0.1 g/L的CaCl2,酵母的產油量達1.504 g/L,比未加CaCl2的酵母產油量上升28.1%。這可能是因為Ca2+在解脂耶羅維亞酵母的油脂累積過程中,對關鍵酶的激活作用比Mg2+和K+更強。并且鈣離子還可以促使細胞線粒體內ATP 的合成,為微生物的生長提供能量,從而促進微生物生長和油脂累積[20]。

圖3 無機鹽對產油的影響Fig.3 Effect of inorganic salts on oil production

2.4 田口式正交實驗

正交實驗結果表見表2。田口設計中是以信噪比來作為質量特性的衡量指標的,根據實驗要求不同將信噪比分為望目特性、望大特性和望小特性。望目特性是指期望目標值圍繞某點波動,望大是希望質量特性值越大越好,望小是希望質量特性值越小越好[20]。本實驗是提高酵母的產油量,選取望大特性。利用Minitab 17對表2中的數據進行分析得到表3和表4。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results

對表3的均值響應表和表4的信噪比響應表進行分析,可知各因素對產油量影響的程度為A(C/N)>B(MgSO4·7H2O)>C(CaCl2)>D(KH2PO4)。分析表5均方差結果顯示,C/N和MgSO4·7H2O對解脂耶羅維亞酵母產油量的影響極顯著,CaCl2影響顯著,而KH2PO4影響不顯著。綜上可以得出在培養基組分為A3B3C2D4時油脂的產量最大,同時信噪比最大,結果具有最強的穩健性。即培養基的C/N為100∶1(甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L時,該株解脂耶羅維亞酵母油脂產量最大。以此優化的培養基配方進行驗證實驗。

表3 均值響應表Table 3 Mean response table

表4 信噪比響應表Table 4 Signal to noise ratio response table

表5 均值方差分析表Table 5 Analysis of variance of mean value

注：*代表影響顯著,**代表影響極其顯著。

2.5 驗證實驗

田口設計的一大優點是可以對最優條件進行預測,由于正交實驗得到的最佳條件在正交表中并不存在,故用Minitab 17中的DOE-田口-預測田口結果對A3B3C2D4進行預測,預測結果為油脂產量1.782 g/L。按照優化好的培養基進行實驗,油脂產量為1.859 g/L。實驗結果與預期值較為接近,且比優化前的油脂產量提高了48.5%,說明此優化方案達到了預期的優化效果。

3 結論與討論

采用野生型Y.lipolytica2.2087發酵生產油脂,通過單因素實驗確定對油脂產量影響較大的因素。按照田口法設計了L16(44)的實驗方案進行實驗,分析實驗中各因素水平的均值情況和信噪比情況確定了對油脂產量影響最大的因素為C/N,MgSO4·7H2O濃度CaCl2濃度KH2PO4濃度。最佳的培養基組合為:C/N為100∶1(甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L。28 ℃ 180 r/min培養4 d后油脂產量達到1.859 g/L,與田口設計預期值接近,且比優化前的油脂產量提高了48.5%,此時胞內油脂含量為35.4%。據趙春海等報道Y.lipolytica分別以葡萄糖、果糖、蔗糖及菊粉等糖類物質為碳源,硫酸銨和酵母提取物為氮源,細胞體內的油脂含量約為30%,產量約為2 g/L[21]。本研究中以粗甘油為原料發酵解脂耶羅維亞酵母,油脂產量為1.859 g/L。原料甘油較糖類更為便宜,且以硫酸銨作為唯一氮源,這表明以甘油為碳源生產油脂同樣具有明顯優勢。

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Establishment of optimum media for lipid production inYarrowialipolyticaby Taguchi method

XIA Qian-jun,WANG Yue-jiao,WANG Fei,LI Xun*

(Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

Taguchi orthogonal experimental design(TOED)was used to optimize the fermentation media of lipid production byY.lipolyticawith crude glycerol as carbon source in this study. Based on single factor test,TOED was established by Minitab 17. Then the means and SNRs(Signal to noise ratio)of each factor were analyzed and the results showed that C/N and the concentration of MgSO4·7H2O in the medium had a substantial significant impact on lipid production,the CaCl2concentration had a significant influence on lipid production. The optimal medium composition was C/N 100∶1(crude glycerol 50 g/L,ammonium sulfate 1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L. The fermentation broth with optimal media were incubated at 28 ℃ and 180 r/min for 4 days,the lipid yield reached 1.859 g/L and the predicted lipid yield of fitted model was 1.782 g/L. The oil yield increased by 48.5% compared with the orginal.

Yarrowialipolytica;microbial lipids;culture optimization;minitab;Taguchi design

2016-08-04

夏乾竣(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：解脂耶羅維亞酵母產單細胞油脂，E-mail：jsxqj1991@163.com。

*通訊作者:李迅(1975-)，女，博士，教授，研究方向：生物質能源與化學品，E-mail：xunlee@njfu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31270612);江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(PPZY2015C22)。

TS201.2

B

:1002-0306(2017)03-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.030