海參內臟酶解工藝條件的優化

楊佳洪,黃義松,魏好程,何傳波,鄧 婷,熊何健,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.廈門佰翔空廚食品有限公司,福建廈門 361006)

海參內臟酶解工藝條件的優化

楊佳洪1,黃義松2,魏好程1,何傳波1,鄧 婷1,熊何健1,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.廈門佰翔空廚食品有限公司,福建廈門 361006)

建立海參內臟酶解工藝條件,為海參內臟活性物質工業化生產提供參考。以蛋白水解度和清除DPPH自由基為指標,分析比較了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶對海參內臟的酶解效果及產物的抗氧化活性,篩選出中性蛋白酶為最佳水解酶,以水解度為指標,通過響應面分析法優化海參內臟酶解工藝。結果表明:最優酶解條件為:酶添加量2000 U/g,料液比1∶12 g/mL,酶解溫度50 ℃,酶解液pH7.0。在最優條件下,比較不同酶解時間酶解產物的抗氧化活性,發現第10 h時酶解產物具有較好的抗氧化活性,清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.26、5.33 mg/mL。中性酶對海參內臟酶解工藝優化合理、可行,酶解產物具有較好的抗氧化活性。

海參內臟,酶解,蛋白水解度,抗氧化

海參(Sea cucumber,Holothuians)屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)的總稱。作為一種傳統的海珍品,海參是重要的海洋食物和藥物資源,深受中國、日本和韓國等亞洲國家消費者的喜愛[1]。海參含有多種生理活性物質,國內外學者相繼從中分離出多種功能成分,如海參多糖[2]、海參皂苷[3]、海參蛋白質及多肽[4]等,它們具有抗疲勞、抗氧化、降血脂等諸多功能活性[5-6]。

隨著我國人民生活水平的不斷提高,海參的需求量不斷增加,消費市場不斷擴大。然而海參內臟的加工技術和綜合利用程度還較低,加工過程中產生的下腳料——海參內臟,常被當作廢棄物,尚未得到充分開發利用,直接丟棄會造成環境污染和資源浪費[7]。劉小芳等[8]研究指出海參內臟中含有蛋白質、皂苷和多糖等營養及活性物質。因而,研究海參內臟中的營養成分的分離制備對提高海參的綜合利用和保護環境都有重要的現實意義,對促進海參精深加工產業的發展也有重要意義[9]。

本研究以海參內臟為原料,以水解度和DPPH自由基清除率為指標,研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對海參內臟水解效果和抗氧化活性的影響,篩選出水解海參內臟制備酶解活性產物的最佳用酶為中性蛋白酶,為獲得更好的酶解效果,需進行適度酶解。因此通過單因素實驗和響應面分析優化酶解條件,為海參內臟酶解產物制備和開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參內臟 新鮮海參內臟采自福建霞浦,經凍干后,用試樣粉碎機將其粉碎,過40目篩,低溫保存備用。

中性蛋白酶(酶活力為1.34×105U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力為4.55×104U/g)、堿性蛋白酶(酶活力為1.53×105U/g) 購于諾維信生物技術有限公司;三氟乙酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購于Sigma公司;甲醛AR等其余試劑 國藥分析純。

FA1004型電子天平 上海精科天平;UV-2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯儀器公司;LEAD-2 pH計 上海奧豪斯儀器有限公司;JDG-0.2T真空凍干機 蘭州科近真空凍干有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參內臟酶解工藝流程 稱取適量海參內臟粉,按1∶9 g/mL的液料比加入去離子水,在適當的恒溫水浴中不斷攪拌,直到達到蛋白酶最佳酶解溫度后,保溫5 min,用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節至各蛋白酶的最適pH,加入適量蛋白酶,酶解5 h。酶解結束后,將酶解液放于95～100 ℃加熱15 min鈍化滅酶,再調節酶解液pH至中性,4 ℃低溫離心(10000 r/min,15 min),取上清凍干后備用。

1.2.2 蛋白酶的篩選 不同的蛋白酶具有其各自特有的酶切位點[10],在合適的條件下對蛋白質的酶解效果也不一樣,本實驗選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶3種不同的蛋白酶對海參內臟酶解,酶解條件如表1,以水解度和DPPH自由基清除率為指標,選擇合適的蛋白酶。

表1 海參內臟酶解參數Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of sea cucumber visceral

1.2.3 單因素實驗 以蛋白質水解度為指標,固定酶解時間為5 h,選擇影響酶解反應的酶解溫度、pH、料液比和加酶量進行單因素實驗,分析各單因素對水解度的影響。設定基礎條件為:料液比1∶9 g/mL,pH調至7.0,加酶量2000 U/g,酶解溫度為50 ℃,改變其中一個因素,固定其他因素不變。各個因素變化梯度分別為:pH(6.0,6.5,7.0,7.5和8.0)、酶解溫度(40、45、50、55和60 ℃)、料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18和1∶21 g/mL)、加酶量(500、1000、2000、3000和4000 U/g)。

1.2.4 響應面優化實驗 應用Design Expert 軟件,根據Box-Behnken中心組合設計原理[11],在單因素實驗基礎上,綜合考慮實際生產的需要,選取酶解影響因素中的pH、酶解溫度、料液比3個因素,以水解度為響應值,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗,進一步優化海參內臟酶解參數。其響應面因素水平表如表2所示。

表2 酶解法響應面因素水平表Table 2 Factors and levels used in respond surface methodology

1.2.5 酶解時間對酶解產物的影響 在優化的酶解條件下,分別酶解1、5、10、15、20 h。分析不同酶解時間酶解物清除DPPH自由基的能力。

1.2.6 酶解產物抗氧化活性研究 制備最優條件下海參內臟酶解產物,并進行抗氧化活性實驗。以清除DPPH自由基和羥自由基為指標,以GSH為對照,研究其抗氧化能力。

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白水解度的測定 采用甲醛滴定法[12]:吸取5 mL樣液,加75 mL水,用0.01 mol/L NaOH標準液滴定至pH8.2。加入10 mL甲醛溶液,滴定至pH9.2。記下消耗NaOH標準液的升數,同時用80 mL水做空白實驗。

式中:X為1 mL的樣液中氨基態氮的含量(g);C為NaOH溶液濃度(mol/L);V1為樣品液NaOH溶液的消耗量(mL);V0為空白液NaOH溶液的消耗量(mL);MN為氮的摩爾質量(g/mol)。

1.3.2 蛋白質含量測定 參照GB/T5009.5-2003(凱氏定氮法)。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測定 參考文獻 [13],配制2×10-4mol/L的DPPH溶液。取2 mL樣液加入2 mL DPPH溶液。室溫放置30 min后,記錄517 nm吸光值Ai;用2 mL 95%乙醇溶液與2 mL超純水調零。在2 mL DPPH溶液中加入2 mL 95%乙醇溶液,記錄吸光值為Ac,即對照,用2 mL樣品液與2 mL 95%乙醇混合為空白Aj。根據公式計算樣品的清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.3.4 羥自由基清除活性測定 采用水楊酸法[14];依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液,9.0 mmol/L水楊酸溶液和9.0 mmol/L的雙氧水各1 mL,最后加入2 mL樣品溶液。37 ℃水浴30 min,蒸餾水調零,在526 nm處測定吸光度值記為A1。以去離子水代替樣品溶液,其他步驟同上,得A0。2 mL樣品溶液加3 mL蒸餾水在526 nm處測得吸光度,得A2。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

Chen等[15]指出活性肽的活性不僅與其分子大小,還和其末端氨基酸的種類有關,而不同酶酶切位點不同,其決定了水解肽鍵的數量和位置,使得酶解產物活性也不同,因此酶的選擇決定了產物的組成、風味、功能等性質。本實驗選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對海參內臟進行水解,三種蛋白酶酶解水解度及酶解液對DPPH自由基清除活性結果見圖1。堿性酶的水解度最高,達到23.20%,中性酶和木瓜酶相當,達到20%,略低于堿性酶,但是中性酶的DPPH自由基清除率最高,達到15.65%。楊濤[16]等在研究中使用堿性酶酶解海參內臟水解度雖然高達67.19%,但是其在清除羥自由基IC50為11.7 mg/mL,低于本文5.33 mg/mL。因此,綜合考慮選用中性酶為水解用酶。

圖1 不同蛋白酶水解度和DPPH自由基清除率Fig.1 Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging activities of different proteases

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 溫度對海參內臟酶解效果的影響 結果如圖2，水解度呈先升高再降低的趨勢,在50 ℃時水解效果最好。這是因為在酶解過程中,適當的溫度可以增加酶的活力,促進水解,若溫度過高或過低,使蛋白和酶變性則對水解不利。

圖2 酶解溫度對水解度的影響Fig.2 The influence of hydrolysis temperature on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.2 pH對海參內臟酶解效果的影響 如圖3可知,水解物的水解度先逐步上升,在pH為7.0時,水解度達最大值,pH大于7.0以后水解度又呈下降的趨勢。故選擇pH為7.0左右合適。

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 The influence of pH on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.3 加酶量對海參內臟酶解效果的影響 如圖4可知,隨著酶添加量的增大水解度呈上升趨勢,但過了2000 U/g曲線斜率變小,周雪松[17]的研究表明,當酶的用量大于最適濃度時,過量的酶很難與底物接觸,其對底物蛋白的水解能力不會明顯提高,如果酶量過大甚至會引起酶的自溶增強。考慮到實驗成本和試劑最大利用率,加酶量選為2000 U/g。

圖4 加酶量對水解度的影響Fig.4 The influence of enzymatic dosage on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.4 料液比對海參內臟酶解效果的影響 如圖5可知,當料液比為1∶9 g/mL到1∶12 g/mL時,水解度逐漸增大,當料液比再逐漸增大時,其水解度逐步下降。這是因為隨著料液比的增大,降低了體系中的酶濃度,使得酶促反應速度下降,水解度降低[18]。故選擇料液比1∶12 g/mL左右較為合適。

圖5 料液比對水解度的影響Fig.5 The influence of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis effects

2.3 海參內臟酶解參數的響應面法優化

2.3.1 實驗結果和分析 固定酶解時間5 h,以蛋白水解度為指標,響應面測定結果和響應面分析結果如表3和表4所示。對表3實驗數據進行多元回歸擬合,得到水解度對pH(A)、溫度(B)、料液比(C)的二次多項回歸模型方程為:

Y=18.78+0.037A-0.028B+0.27C-0.12AB+0.047AC-0.20BC-0.57A2-1.24B2-1.87C2,(R2=0.9972)

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 Respond surface methodology design and experimental results

從模型方差分析(表4)可知,模型p值<0.0001,模型F值為75.37,表明該二次多項回歸模型高度顯著,失擬項0.3304>0.05,不顯著,表明模型與實際情況擬合很好,預測值與實測值之間具有高度的相關性,可以應用到理論預測[19]。其中料液比對水解度影響極顯著(p<0.01)。pH和溫度對水解度影響不顯著(p>0.05),影響蛋白水解度因素的主次順序為:料液比>pH>溫度。

表4 響應面實驗結果方差分析Table 4 ANOVA for response surface

注:表中“**”代表極顯著,“*”代表顯著。

2.3.2 響應面圖分析 采用Design-Expert 8.06軟件作圖,各因素對海參內臟酶解水解度影響的相應面如圖6?？梢钥闯龈鱾€因素pH(A)、溫度(B)、料液比(C)在選定的范圍內,均存在極值。在溫度(B)和pH(A)的交互關系圖中,當固定pH時,溫度對水解度呈先增加后降低的趨勢;當固定溫度時,pH對水解度的影響也呈先增加后降低的趨勢。同樣的在pH(A)和料液比(C)的交互關系圖,溫度(B)和料液比(C)的交互關系圖中各個因素對水解度的影響也是如此,這與單因素實驗結果吻合。比較三個因素的兩兩交互作用圖,溫度(B)和料液比(C)的交互關系對水解度的影響最大,表現為曲面比較陡。而pH(A)和料液比(C)的交互關系以及pH(A)和溫度(B)對水解度的影響相對較小,曲面圖表現為相對平緩,這與方差結果分析一致。

圖6 因素間相互作用的響應面圖Fig.6 Response surface figure about effect of relationship between factors

圖7 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on DPPH free radical scavenging activities

由SAS 8.2軟件對實驗結果進行統計分析處理,得出海參內臟酶解最優條件為:酶解溫度為49.91 ℃,pH為7.02,料液比為1∶12.22 g/mL。模型預測水解度最大為18.79%?？紤]到實際實驗,選擇溫度為50 ℃,pH為7.00,料液比為1∶12 g/mL,實測值為19.22%,驗證了模型能較好地預測實際水解度。

2.4 酶解時間對酶解產物的影響

用中性蛋白酶在最優酶解條件下酶解,分別酶解1、5、10、15、20 h,測得相應酶解產物清除DPPH自由基活性的能力,結果如圖7所示。水解液清除DPPH自由基活性的能力隨酶解時間先增高,在10 h時后逐漸趨于平緩。這是因為隨酶解時間的增加,大分子肽被酶解成小肽,在10 h后酶解基本完全。有研究表明如果肽段過長,可能由于肽的結構關系,將使具有抗氧化性的氨基酸殘基不可暴露出來,使抗氧化性降低[20]。

2.5 酶解產物清除自由基活性

圖8和圖9分別為,在最優酶解條件下,海參內臟在第10 h酶解產物對DPPH自由基和羥自由基的清除作用。可以看出海參內臟酶解產物對DPPH自由基和羥自由基清除率影響趨勢和GSH基本一致。海參內臟酶解產物和GSH清除DPPH自由基的IC50分別為1.26、0.71 mg/mL;清除羥自由基的IC50分別為5.33、3.75 mg/mL。說明海參內臟中性酶酶解產物具有良好的清除自由基活性。

圖8 海參內臟酶解產物清除DPPH·活性Fig.8 The scavenging activity of hydrolyzate of sea cucumber viscera on DPPH·

圖9 海參內臟酶解產物清除·OH活性Fig.9 The scavenging activity of hydrolyzate of sea cucumber viscera on ·OH

3 結論

利用海參內臟為原料,以水解度和DPPH自由基清除率為指標,綜合考慮酶解產物得率和抗氧化活性,確定中性酶為最適用酶。以水解度為指標,通過單因素實驗和響應面設計分析優化中性酶酶解海參內臟的工藝條件。確認最佳酶解條件為:酶添加量2000 U/g,料液比1∶12 g/mL,酶解溫度50 ℃,酶解pH7.0,在此條件下水解度為19.22%,與模型預測結果相近。在抗氧化活性研究中,酶解產物在第10 h具有較高的清除DPPH自由基和羥自由基能力,其中清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.26、5.33 mg/mL,表明本實驗方法對海參內臟中活性成分的利用開發具有參考價值。

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Optimization for extracted conditions of sea cucumber visceral

YANG Jia-hong1,HUANG Yi-song2,WEI Hao-cheng1,HE Chuan-bo1,DENG Ting1,XIONG He-jian1,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Xiamen Fliport Catering,Xiamen 361006,China)

To establish sea cucumber viscera hydrolysis conditions and provide a reference for the industrial production of sea cucumber viscera active substance. Degree of hydrolysis and clearing DPPH free radicals were selected as the indexes to compare the effect of hydrolysis and product antioxidant activity of neutral protease,alkaline protease,papain. Neutral protease was selected as the best protease. The hydrolysis conditions was optimized by response surface methodology. The results showed the optimal hydrolysis conditions:enzyme dosage 2000 U/g,material/liquid 1∶12 g/mL,hydrolysis temperature of 50 °C,the hydrolysis conditions were pH7.0. Under this selected technological parameter,the effects of different extraction time on antioxidant activity were compared. Found that the hydrolyzate had good antioxidant activity at 10 h. Half inhibitory concentrations of DPPH radical,hydroxyl free radical were 1.26 and 5.33 mg/mL. Using a neutral enzymatic hydrolysis of sea cucumber offal process optimization was reasonable and feasible. Hydrolyzate has stronger antioxidant activity.

sea cucumber viscera;digestion;protein hydrolysis;antioxidant

2016-08-01

楊佳洪(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：功能性食品，E-mail:13666024077@163.com。

*通訊作者:熊何健(1968-)，男，碩士，教授，研究方向：功能性食品，E-mail:hjxiong@jmu.edu.cn。

廈門市科技計劃項目(3502Z20153014)；廈門市海洋漁業局(南方海洋中心)科技類項目(14GZP007NF07)；福建省食品微生物與酶工程重點實驗室開放基金項目(M20130910)。

TS254.9

B

:1002-0306(2017)03-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.026