金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘導人結腸癌HT29細胞凋亡

和 磊,羅 婧,王亞蕓,石玉杰,任建武,*

(1.北京林業大學生物科學技術學院,北京 100083;2.北京大學醫學部藥學院,北京 100191)

和 磊1,2,羅 婧1,王亞蕓1,石玉杰2,任建武1,*

(1.北京林業大學生物科學技術學院,北京 100083;2.北京大學醫學部藥學院,北京 100191)

目的:研究金釵石斛脂溶性生物堿提取物對人結腸癌HT-29細胞生長的抑制作用及其誘導細胞凋亡的分子機制。方法:MTT法檢測金釵石斛脂溶性生物堿提取物對HT-29細胞存活率的影響,Hoechst33342染色法觀察細胞形態學變化,流式細胞儀檢測胞內活性氧水平、線粒體膜電位、細胞周期和細胞凋亡率變化;蛋白免疫印跡檢法測蛋白Caspase-3,9和胞內細胞色素C的表達。結果:金釵石斛脂溶性生物堿提取物能降低HT-29結腸癌細胞存活率,呈劑量和時間效應,48 h半數抑制濃度(IC50)為0.72 mg/mL;金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導HT-29細胞凋亡,并誘導細胞周期阻滯于G2期;金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘使線粒體膜電位降低,胞內活性氧濃度升高;激活型Caspase-9,3與胞內細胞色素C表達水平增高。結論:金釵石斛脂溶性生物堿提取物對HT-29結腸癌細胞的生長具有抑制作用并誘導細胞凋亡,其可能通過線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。

金釵石斛,脂溶性生物堿,HT-29細胞,細胞凋亡,活性氧

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種對人類威脅巨大的高發惡性腫瘤,其發病率近年來呈逐年上升趨勢,在全球惡性腫瘤發病率中居第三位,死亡率居第二位,世界范圍內每年大約有100萬新增結腸癌患者[1-2]。目前結腸癌的治療主要以手術為主,但術后復發率高,5年生存率較低,僅為50%左右[3-4],尚無其他有效的療法。

基于天然產物的抗腫瘤新藥研發一直是近年來研究的熱點,天然產物中的活性成分通過抑制增殖或誘導凋亡等方式殺死腫瘤細胞,臨床常用的抗腫瘤藥物紫杉醇、三尖杉等就是以天然產物為基礎研發的[5-6]。金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl)為蘭科石斛屬植物,其主要化學成分包括生物堿類、多糖類等,其中又以石斛堿含量最高是其特征性成分[7-8]。生物堿具有降血糖、抗腫瘤、解熱止痛等功效,以往研究中發現,金釵石斛生物堿在減緩大鼠糖性白內障癥狀[9]減輕腦部的缺血性損傷[10]等方面有良好應用。近年來其抗腫瘤作用越來越受到重視,研究表明金釵石斛生物堿能抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡[11-12]。但目前尚未有金釵石斛脂溶性生物堿對人結腸癌細胞HT-29作用的報導,因此本文探究了金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞凋亡的誘導作用及可能機制,以期為合理開發利用石斛屬資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HT-29人結腸腺癌細胞 中國醫學科學院腫瘤研究所;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS) 美國Hyclone公司;RPMI-1640培養液 美國Gibco公司;MTT、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、Hoechst 33342、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、抗Caspase-3,9抗體、抗Cytochrome C 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L) 碧云天生物試劑公司;BCA試劑盒 南京建成生物科技有限公司;PI(碘化丙啶) 北京邁晨科技有限公司;RNA酶 北京索萊寶科技有限公司。

311氣套式細胞培養箱、酶標儀 美國Thermo公司;CKX31-A12PHP倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;轉膜儀 美國Bio-Rad公司;TD25-WS臺式離心機 長沙平凡儀器儀表公司;DYY-10C電泳儀、DYCZ-20電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液(100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)于37 ℃、5% CO2條件下進行細胞培養,0.25%胰蛋白酶消化,傳代。

1.2.2 金釵石斛脂溶性生物堿的制備 金釵石斛脂溶性生物堿的提取參照文獻[13-15],切片、干燥(75 ℃,48 h)、磨粉,80%(v/v)乙醇85 ℃回流提取4次,每次3.5 h,合并提取液,旋轉蒸發儀65 ℃回收乙醇,得到濃縮水液,旋蒸儀90 ℃蒸干濃縮水液水分,得到黑色浸膏,5%鹽酸溶解浸膏,過濾酸水液,在過濾后的酸水液里加入NaCl,再次過濾,氯仿萃取二次過濾后的酸水液,萃取比例為酸水液∶氯仿(3∶1(v/v)),萃取8～10次。合并氯仿層,旋蒸儀回收氯仿。用純凈水將回收至小體積的氯仿層洗至中性,水洗比例為氯仿∶水(3∶1(V/V)),水洗 10次。合并水洗后的氯仿層,旋轉蒸發儀50 ℃回收氯仿后即得脂溶性生物堿提取物。

1.2.3 MTT法測定細胞存活率 將對數期的HT-29細胞接種于96孔細胞培養板(1×104/孔),每個濃度設置4個復孔,貼壁后加入終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mg/mL的金釵石斛脂溶性生物堿提取物,分別培養24 h和48 h;吸去培養液,加入20 μL MTT溶液(5.0 mg/mL),37 ℃溫育4 h,棄去上清液,每孔加入100 μL溶解液,室溫繼續孵育。結晶全部溶解后,測定570 nm處OD值,計算細胞存活率:

存活率(%)=(實驗組OD值/空白組OD值)×100。

計算IC50:IC50=lg-1[Pm-n(∑ S-0.5)]

Pm:設計的最大加藥濃度對數值;n:為相鄰濃度對數值之差;∑ S:為各組生長抑制率之和;0.5為經驗常數。

1.2.4 Hoechst 33342染色 將HT-29細胞接種于35 mm共聚焦小皿上(3×105/皿),細胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8和1.6 mg/mL),處理16 h后吸去培養液,PBS洗滌2次,加入預冷0.5 mL 4%多聚甲醛,室溫固定30 min,PBS洗滌3次,加入500 μL Hoechst 33342染液染色(2 μg/mL),4 ℃染色30 min,PBS洗滌2次,加400 μL PBS,倒置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡率 將對數期HT-29細胞接種于35 mm細胞培養皿(6×105/皿),細胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),48 h后收集細胞。800 r/min室溫離心3 min。PBS重懸細胞,收集1×105細胞,加入200 μL的Binding Buffer(緩沖液)懸浮細胞,加入10 μL Annexin V-FITC混勻,4 ℃孵育30 min,加入5 μL PI染液,室溫、避光染色5 min,流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.6 流式細胞儀檢測線粒體膜電位 將HT-29細胞接種于6孔細胞培養板(3×105/孔),細胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL)。繼續培養48 h后,收集6×105個細胞,0.5 mL細胞培養液重懸,加入0.5 mL JC-1染色工作液,混勻,37 ℃細胞培養箱孵育20 min,使用JC-1染色緩沖液洗滌細胞3次。用適量的JC-1染色緩沖液重懸細胞,流式細胞儀檢測胞內熒光強度。

1.2.7 胞內活性氧水平的檢測 將對數生長期的HT-29細胞接種于60 mm的細胞培養皿中(5×105/皿),細胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8和1.6 mg/mL)。處理48 h后,消化收集細胞,800 r/min室溫離心5 min,棄上清。用PBS重懸細胞。加入1 mL DCFH-DA(10 μmol/L),37 ℃細胞培養箱內孵育20 min,預冷的PBS洗滌細胞兩次。加入500 μL PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平變化。

1.2.8 金釵石斛脂溶性生物堿對細胞周期的影響 將對數期的HT-29細胞接種于60 mm細胞培養皿中(2×106/皿),細胞貼壁后加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),繼續培養48 h后消化收集細胞,于800 r/min室溫離心3 min,用PBS洗滌細胞2次,收集1×106個細胞,離心去上清PBS,用70% 冰乙醇混勻固定,4 ℃保存過夜。2000 r/min 室溫離心5 min,去除乙醇,PBS洗滌細胞2次。加入100 μL RNase A,并于37 ℃水浴30 min;加入400 μL PI染液,4 ℃避光染色30 min,采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.9 Western Blot檢測凋亡相關蛋白表達 將對數期的HT-29細胞接種于60 mm細胞培養皿(3×106/皿),細胞貼壁后,加入不同濃度金釵石斛生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),48 h后消化收集細胞,800 r/min室溫離心3 min,去上清,加入200 μL PMSF的RIPA細胞裂解液,冰上裂解30 min,BCA法測樣品蛋白濃度,以12% SDS-PAGE分離,然后將蛋白轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,ECL法通過X-光片曝光顯影從而檢測相應蛋白表達。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞存活率的影響

如圖1所示,經金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理24 h后,隨著脂溶性生物堿提取物濃度的增加,HT-29細胞的存活率由93.32%±2.73%下降至49.65%±3.34%;處理48 h后,細胞存活率由91.49%±1.69%下降至28.19%±1.17%;并求得48 h的IC50為0.72 mg/mL。表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物對細胞的生長有顯著的抑制作用,具有明顯的時間與濃度效應關系。

圖1 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞存活率的影響Fig.1 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the survival rate of HT-29 cells

2.2 金釵石斛脂溶性生物堿誘導細胞凋亡

如圖2所示,圖中箭頭指示破碎細胞核,可見正常組細胞細胞核完整,少見凋亡小體產生,表明凋亡細胞數目較少;而經0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿處理 48 h和Hoechst 33342染色后,HT-29細胞豐潤,細胞核固縮、碎裂成小塊,凋亡小體隨著處理濃度增加而增多,并呈濃度依賴性。結果表明,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能夠誘導HT-29細胞發生凋亡。

圖2 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞形態的影響Fig.2 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the cell morphology of HT-29 cells

2.3 金釵石斛脂溶性生物堿對細胞凋亡率影響

圖3 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞凋亡率的影響Fig.3 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on apoptosis rate of HT-29 cells

如表1所示，與對照組(7.11%±0.27%)相比，0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理組細胞的凋亡率顯著升高(p<0.01)，分別為13.92%±0.18%、24.74%±0.33%和33.34%±0.38%，進一步證實金釵石斛脂溶性生物堿能有效誘導HT-29細胞凋亡。

表1 金釵石斛脂溶性生物堿處理對人結腸癌細胞HT-29凋亡率的影響Table 1 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on apoptosis rate of HT-29 cells(Mean±SD)

注:*p<0.05,**p<0.01,與空白組比較。

2.4 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞線粒體膜電位的影響

JC-l是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)ΔΨm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質中,產生紅色熒光;線粒體膜電位降低時,JC-1以單體形式存在于胞漿中,發出綠色熒光,因此可通過熒光顏色的強度比值轉變來檢測線粒體膜電位的變化[16-17]。如圖4所示,與空白對照組相比,經0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿處理48 h后,HT-29細胞中紅綠熒光強度比值分別為295.49±4.66、262.2±7.28和173.39±3.59,與空白對照組318.54±3.24比較,差異極顯著(p<0.01),表明HT-29細胞線粒體膜電位隨著加入金釵石斛脂溶性生物堿濃度升高而降低。以上結果表明,金釵石斛脂溶性生物堿能誘使HT-29細胞線粒體膜電位降低。

圖4 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the mitochondrial membrane potential in HT-29 cells

2.5 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞內活性氧水平的影響

活性氧(ROS)是細胞內正常代謝的產物,在生物系統內發揮著雙重作用。實驗中利用DCFH-DA熒光探針進行胞內活性氧檢測,DCFH-DA本身沒有熒光,可以穿過細胞膜,進入細胞內后被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH本身無熒光,細胞內的活性氧進一步氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。通過檢測DCF的熒光強度值變化來檢測胞內活性氧水平的改變[18-19]。如圖5所示,經0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理48 h后,胞內DCF的熒光強度水平分別為60.5±2.68、78.62±4.75、92.84±5.99,與空白對照組(26.54±8.54)相比差異極顯著(p<0.01),呈濃度依賴性。結果表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導胞內ROS水平升高。

圖5 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞胞內活性氧水平的影響Fig.5 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the level of intracellular reactive oxygen species in HT-29 cells

2.6 金釵石斛脂溶性生物堿對細胞周期分布影響

細胞周期的調控是細胞凋亡過程中一個重要因素,流式細胞儀檢測金釵石斛脂溶性生物堿提取物對細胞細胞周期分布的影響。如圖6所示,經0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理48 h后的HT-29細胞G2期比例逐漸升高,其G2期比例分別為29.69%±1.89%,59.7%±2.86%和89.64%±4.64%,均顯著高于對照組(15.69%±2.96%)(p<0.01),出現明顯的G2期阻滯,呈劑量依賴關系。以上結果表明金釵石斛脂溶性生物堿能誘導HT-29細胞G2期阻滯從而抑制細胞生長。

圖6 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞周期的影響Fig.6 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the cell cycle distribution in HT-29 cells

2.7 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細胞內Caspase-3,9和細胞色素 C表達的影響

為進一步闡明金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘導HT-29結腸癌細胞凋亡的分子機制,經0.4、0.8、1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理HT-29細胞48 h后,Western blot檢測細胞Caspase-3,9和細胞色素C蛋白表達量變化。結果如圖7所示,Cyt C為促凋亡因子,正常細胞中的Cyt C主要定位于線粒體,細胞質中表達水平很低,細胞受到藥物刺激后從線粒體內釋放到細胞質中誘導細胞凋亡[20],經脂溶性生物堿處理后,胞質中細胞色素C蛋白表達水平升高。Caspase蛋白是重要的凋亡執行者,在正常細胞中處于非活化的酶原(Procaspase)形式,Procaspase酶原被剪切為激活型Caspase(Cleaved caspase)時近一步切割相應底物誘導細胞發生凋亡[21]。由圖7中結果可知隨著藥物處理濃度增加激活型Caspase-3(Cleaved caspase-3)與Caspase-9(Cleaved caspase-9)表達升高,呈濃度依賴效應,表明Caspase-9,3被剪切激活,而空白對照組未見激活型Caspase活性片段,表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘導細胞凋亡可能與上調促凋亡蛋白細胞色素C表達量及剪切激活Caspase-3,9活性有關。

圖7 金釵石斛脂溶性生物堿對Caspase-3,9和細胞色素C表達影響Fig.7 Impacts of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on protein expression of Caspase3,9 and Cyt C

3 討論與結論

細胞凋亡(Apoptosis)是在多種調控因子共同作用下發生的,是維持內環境穩定的重要機制之一[22]。很多抗腫瘤藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡產生療效,目前已將藥物是否能誘導腫瘤細胞凋亡作為藥物是否具有抗腫瘤效應來進行新藥物的研發的前提[23]。細胞凋亡同時是一個細胞自我破壞的生理過程,大致分為外部死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網途徑。線粒體是細胞生命活動的控制中心,不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心,而且也是細胞凋亡的調控中心。線粒體膜的通透性轉換(mitochondrial permeability transition,MPT)及線粒體膜電位改變更是在線粒體細胞凋亡途徑中發揮了關鍵作用。ROS濃度增加可以誘發氧化應激引起線粒體損傷,進而使線粒體膜電位降低同時增強線粒體膜的通透性[24-25],促使細胞色素C(Cytochrome C,Cyt c)等促凋亡因子從線粒體釋放到胞漿中[26]。大量研究表明,Cyt c等凋亡相關因子從線粒體釋放到胞漿中是線粒體凋亡途徑細胞凋亡的關鍵步驟,Cyt c及凋亡相關因子釋放到胞漿后,細胞色素C與胞漿內的一種凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1結合,進而與線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白Caspase-9酶原結合,Caspase-9位于凋亡級聯反應最上游,是重要的凋亡始動子,Caspase-9酶原活化后,激活Caspase-3酶原從而進一步激活下游細胞凋亡通路[27-29],最終凋亡發生。實驗中經金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理的細胞中檢測到凋亡小體,表明金釵石斛脂溶性生物堿能誘導細胞凋亡,也檢測到胞內活性氧濃度升高,線粒體膜電位降低,同時Cyt c與被剪切為17KD的Cleaved caspase-3,37KD的Cleaved caspase-9激活型分子片段表達增加,表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物可能是通過誘使胞內活性氧濃度升高引起線粒體損傷,進而引起線粒體膜電位降低,促進細胞色素C釋放進而激活線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡的。

綜上所述,本研究表明,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能顯著降低HT-29細胞存活率,且呈濃度時間效應;同時,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導細胞凋亡,使細胞周期阻滯于G2期,提高胞內活性氧濃度,使線粒體膜電位降低,促進細胞色素C釋放,進而激活Caspase-3、9誘導細胞凋亡。綜上所述,金釵石斛脂溶性生物堿提取物凋亡誘導機制可能涉及線粒體凋亡途徑的激活,但其詳細凋亡調控機理尚需進一步實驗研究。

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Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl induced apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells

HE Lei1,2,LUO Jing1,WANG Ya-yun1,SHI Yu-jie2,REN Jian-wu1,*

(1.College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.School of Pharmaceutical science,Peking University Health Science Center,Beijing 100191,China)

Objective:Anti-growth effects of fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl on human colorectal cancer HT-29 cells and its possible apoptotic mechanism were studied. Methods:The MTT assay was used to assess the effect of fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl on survival rate of HT-29 cells;the morphological changes of HT-29 cells were observed with Hoechst 33342 staining;the levels of intracellular reactive oxygen species(ROS),mitochondrial membrane potential(ΔΨm),cell cycle distribution and apoptosis rate were studied using flow cytometry;western blotting analysis was used to detect the expressions of Caspase-9,3,and intracellular cytochrome C. Results:Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl decreased survival rate of human colorectal cancer HT-29 cells in a dose-and time-dependent manner;IC50value for 48 h was 0.72 mg/mL. Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl induced cell apoptosis and cell cycle was arrested in G2 phase;it caused decline of ΔΨm and induced ROS accumulation with increased expression levels of apoptotic proteins such as activated Caspase-9,activated Caspase-3,and level of intracellular cytochrome C. Conclusion:Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl can inhibit the growth of HT-29 cells and induce cell apoptosis,which may be associated with the involvement of the mitochondria-mediated apoptotic pathway.

DendrobiumNobileLindl;fat-soluble alkaloids;HT-29 cells;apoptosis;reactive oxygen species

2016-09-12

和磊(1990-)，男，碩士研究生，研究方向： 天然產物研究與開發，E-mail：18701590313@163.com。

*通訊作者:任建武(1967-)，男，博士，副教授， 研究方向：天然產物研究與開發，E-mail：jianwur@sina.com。

國家自然科學基金項目(31572149)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.024