創傷弧菌產鐵載體菌株的篩選及其誘導條件的響應面優化

楊常娥,魯艷莉,倪捍成,周 詠,寧喜斌,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;2.大連金州新區水產服務管理站,遼寧大連 116100)

創傷弧菌產鐵載體菌株的篩選及其誘導條件的響應面優化

楊常娥1,魯艷莉2,倪捍成1,周 詠1,寧喜斌1,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;2.大連金州新區水產服務管理站,遼寧大連 116100)

創傷弧菌是一種重要的人魚共患致病菌,根據目前已報道的致病因子,產鐵載體是其主要的致病因子之一。以海水中篩選分離出的創傷弧菌為實驗菌株,通過改良金氏培養基(Modified King B,MKB)篩選產鐵載體菌株,通過平板覆蓋法篩選高產鐵載體菌株及紫外可見分光光度計法測定鐵載體活性單位(siderphore units,SU)。基于MKB培養基,選取產鐵載體能力最高的V.vulnificusY8菌株,利用響應面法對其鐵載體活性單位的顯著影響因素包括初始pH、裝液量及碳氮比(C/N)進行優化。響應面優化結果表明:在初始pH7.84、裝液量81.53 mL及碳氮比(C/N)3.06的條件下,鐵載體活性單位預測值為90.7404%,并通過三次平行驗證實驗證明,實際平均SU值和預測SU值接近,較優化前提高了23.73%。響應面優化了MKB誘導產鐵載體條件,實現鐵載體的高效誘導,為日后的進一步研究奠定基礎。

創傷弧菌,產鐵載體,MKB培養基,響應面優化

創傷弧菌廣泛存在于海水及海產品中,感染水產品不僅增加了水產養殖業經濟損失,而且存在嚴重的水產品食用安全隱患;感染人類,導致嚴重的敗血癥和胃腸炎。創傷弧菌的確切致病機制至今尚未完全明了。目前認為該菌可以產生眾多的致病相關物質,其中鐵載體是其主要致病因子之一,另外還包括溶細胞素、金屬蛋白酶、莢膜多糖[1]等。

鐵載體(Siderophore)是生長在低鐵環境中的細菌、真菌合成的一類具有高度專一性的低分子量的鐵螯合劑[2-4]。鐵是微生物生長的必須微量元素,在缺鐵條件下,微生物一般依賴其分泌的螯合劑來溶解、運輸環境中的難溶性鐵。根據目前已分離鑒定的鐵載體類型主要可歸為3類:異羥肟酸類(hydroxmate)、兒茶酚類(cateolate)和羧酸類[5]。

MKB培養基產生鐵載體的主要誘導條件,包括碳氮比(C/N)、初始pH、溫度、初始鹽度及裝液量等,如何確定顯著因子及最適范圍非常重要。通過單因素實驗確定在只改變單一變量的情況下,確定各變量最適范圍,利用Plackett-Burman設計實驗可以從眾多的因素中篩選出顯著影響因素[6],響應面法對關鍵因子進行優化,獲得目的菌株的最佳產鐵載體能力。

目前關于創傷弧菌誘導鐵載體條件的研究甚少,國內外研究關于細菌鐵載體的誘導合成主要是通過培養基誘導和聯鐵物質。其中培養基包括改良蔗糖-天冬氨酸培養基(Modified sugar-aspartic acid,MSA)[7]、改良金式培養基(Modified King B,MKB)[8]、琥珀酸鈉培養基(Succinate medium,SM)[9]、精氨酸培養基(Arginine medium,AM)[10]和檸檬酸鹽培養基(Citrate medium,CM)等;聯鐵物質是指一些鐵的螯合物如2-2′聯吡啶[11-13]、8-羥基喹啉[14],主要是通過極強的螯合作用,使得微生物生長環境處于低鐵或無鐵環境下。聯鐵物質具有極強的毒性且在高溫滅菌前處理中可能釋放致癌物質,因此不利于普通實驗室開展對鐵載體的研究。培養基誘導具有安全、穩定的優點,但是其誘導產量一般較低。基于MKB培養基通過改變培養基碳氮源及外界環境條件,利用響應面優化實驗獲得最佳鐵載體誘導條件,實現鐵載體的高效誘導,為日后的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

創傷弧菌V.vulnificusY2、V.vulnificusY3、V.vulnificusY4、V.vulnificusY5、V.vulnificusY8,為本實驗室從東海海水篩選所得;

鉻天青(Chrome azuorl S,CAS)、氯化鈉、甘油、七水硫酸鎂、α-乳糖 均為分析純國藥集團試劑有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonnium,HDTMA)、磷酸氫二鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純上海凌峰有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯、蛋白胨、酵母浸出粉 上海華康科技開發公司(上海疾控)。

增菌培養基-3% NaCl胰蛋白胨大豆肉湯

誘導培養基:MKB培養基(g/L)(其組成如下:MgSO4.7H2O 2.5 g/L;K2HPO42.5 g/L;甘油 0.5 g/L;蛋白胨5 g/L;pH7-7.2;3% NaCl等),主要用于合成鐵載體,MKB固體培養基添加2%瓊脂。

CAS藍色檢測液:其制備如下:溶液A:將0.079 g的CAS,溶于50 mL去離子水中,再加入10 mL 1 mmol/L的FeCl3溶液(含有10 mmol/L的HCl);溶液B:將0.069 g的HDTMA,溶于40 mL的去離子水中;溶液C:將A溶液沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中,輕輕晃動,使溶液AB混勻,得到溶液C:CAS藍色檢測液[15]。

改進CAS藍色固體檢測平板:參考文獻[8],將MM9緩沖液換為pH6.8的磷酸鹽緩沖液。

MKB-CAS固體檢測培養基:底層為MKB固體培養基,上層覆蓋一層CAS固體藍色檢測培養基。利用CAS平板覆蓋法[16]篩選產鐵載體菌株。

紫外可見光分光光度計UV-VIS 2300 上海天美科學儀器有限公司;臺式pH730精密測試儀 德國WTW;臺式離心機TGL-16G 上海安亭科學儀器廠。

實驗過程中用到的所有玻璃器皿均用6 mol/L HCl浸泡過夜,然后用去離子水沖洗三遍,從而去除附著在容器上的痕量鐵,避免實驗數據的系統誤差。實驗過程中所用試劑及培養基均由去離子水配制,培養基配制器皿均為總體積250 mL的錐形瓶。

1.2 實驗方法

1.2.1 產鐵載體創傷弧菌的篩選 將活化好的實驗菌株用接種針點種于MKB培養基,在恒溫培養箱中37 ℃培養24 h,然后利用 MKB-CAS固體檢測培養基篩選出高產鐵載體菌株,觀察菌落周圍顏色變化,15 min內與CAS發生顏色變化的菌株被定義為潛在型高產鐵載體菌株(Potentially strong siderophore producers,PSSP);而顏色變化不完全或者顏色變化時間超過12 h的菌株被定義為邊緣型產鐵載體菌株(Bordierline siderophore producers,BSP)[17]。

1.2.2 產鐵載體能力的測定 挑取單菌落于MKB培養基中,28 ℃、150 r/min培養24 h后,12000 r/min常溫離心5 min,取等體積無細胞上清液與等體積的MKB培養液(空白對照),同時與CAS檢測液混合,稀釋10倍,室溫下靜置1 h,紫外可見光分光光度計UV-VIS 2300測定其相對OD630。鐵載體活性單位(Sideropphore units,SU)表示鐵載體的產量,SU(%)=[(Ar-As)/Ar]×100,其中Ar是未接種的培養基與等體積CAS混合OD630,As是菌株上清與等體積CAS混合OD630。對細菌產鐵載體能力進行劃分,As/Ar從1.0～0之間以0.2為間隔,每減小0.2增加一個“+”,一般產鐵載體能力較高的細菌其As/Ar低于0.5[18]。

1.2.3 產鐵載體菌株誘導條件的單因素實驗 以鐵載體活性單位為指標,研究最佳碳源、氮源及其初始碳氮比、初始pH、初始鹽度、溫度、裝液量的最佳誘導條件。

1.2.3.1 碳源、氮源對鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養基100 mL,碳源分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、纖維二糖、甘露醇、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉替代甘油,氮源分別用硫酸銨、氯化銨、酵母浸出粉、磷酸氫二銨、草酸銨、酸水解酪蛋白替代蛋白胨。其他條件不變,培養24 h后,按照1.2.2方法測定相對OD630值。

1.2.3.2 初始碳氮比對鐵載體活性單位的影響 在確定最佳碳源、氮源分別為乳糖、酵母浸出粉。分別最佳碳氮比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養24 h后,測定相對OD630值。

1.2.3.3 初始pH對鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養基100 mL,利用臺式pH精密測試儀分別調節其pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,其他條件不變,CAS藍色檢測液自身顏色的變化易受到pH的影響,150 r/min搖床振蕩培養24 h后,將培養基pH調至中性后,測定相對OD630值。

1.2.3.4 初始鹽度對鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養基100 mL,分別用NaCl調節其鹽度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養24 h后,測定相對OD630值。

1.2.3.5 溫度對鐵載體活性單位的影響 MKB培養基100 mL,其他條件不變,置于搖床中,分別調節其溫度為20、25、30、35、40 ℃,150 r/min搖床振蕩培養24 h后,其他條件不變,測定相對OD630值。

1.2.3.6 裝液量對鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養基20、40、60、80、100、120 mL,其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養24 h后,測定相對OD630值。

1.2.4 Plackett-Burman設計實驗 在單因素實驗的基礎上,利用Plackett-Burman篩選出顯著影響因素。選用N=15設計實驗,設定三個中心點,對初始pH、溫度、初始鹽度、裝液量及最佳碳氮比5個因素進行實驗,每個因素分別取低(-1)和高(+1)兩個水平,其中高水平大約為低水平的1.5倍[19],以鐵載體活性單位(SU)為響應值。

1.2.5 中心組合Box-Behnken響應面實驗 根據Plackett-Burman實驗篩選的結果,以鐵載體活性單位為響應值,根據Box-Behnken的中心組合設計原理,設計三因素三水平的響應面實驗(見表1),初始鹽度及溫度分別設為初始值3%和28 ℃。

表1 Box-Behnken實驗設計因子及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.6 數據處理 本實驗用Excel進行單因素實驗數據分析和制圖,利用Minitab17設計Plackett-Burman實驗和分析實驗數據。利用Design-Expert8.0.6設計中心組合Box-Behnken響應面實驗和分析結果。

2 結果與分析

2.1 創傷弧菌產鐵載體菌株的篩選

利用MKB-CAS固體雙層平板覆蓋法篩選出高產鐵載體菌株,并根據顏色變化快慢表明僅V.vulnificusY8菌株為PSSP菌株,而V.vulnificusY2、V.vulnificusY3、V.vulnificusY4、V.vulnificusY5菌株為BSP菌株,待繼續培養3～4 d后出現桔黃色暈圈。典型的產鐵載體菌株出現桔黃色暈圈見圖1A,繼續在室溫條件下放置數個星期后菌株出現明顯紅色暈圈見圖1B,且周圍培養基都變紅。通過測定實驗菌株相對吸收波長OD630值的大小計算出鐵載體活性單位和As/Ar值,并根據As/Ar值確定各個菌株分泌鐵載體能力的等級,如表2所示,其中V.vulnificusY8產鐵載體能力為++++,鐵載體活性單位最大達到65.95%。

圖1 MKB-CAS平板篩選產鐵載體菌株Fig.1 Screening of siderophore-producing strains by MKB-CAS overlay plate method

表2 PSSP菌株產鐵載體能力Table 2 Capacity of PSSP strains producing siderophores

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 最佳初始碳氮比的確定 考察不同的碳氮源對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果分別見圖2和圖3。實驗結果表明在以無水碳酸鈉、碳酸氫鈉作為碳源的培養基中,V.vulnificusY8菌株沒有生長,在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇作為碳源的培養基中V.vulnificusY8菌株生長良好,但沒有產生鐵載體,在以可溶性淀粉、乳糖和纖維二糖作為碳源的培養基中生長良好且產生鐵載體,產鐵載體能力如圖2所示,其中在乳糖作為碳源的培養基中鐵載體活性單位達到最高,為86.88%,確定為最佳碳源。在以草酸銨作為氮源的培養基中V.vulnificusY8菌株未生長,在以硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨作為氮源的培養基中V.vulnificusY8菌株生長良好,但未產生鐵載體,在以酵母浸出粉、酸水解酪蛋白為氮源的培養基中生長良好且產生鐵載體,產鐵載體能力如圖3所示,其中在酵母浸出粉作為氮源的培養基中鐵載體活性單位達到最高,為86.52%,確定為最佳氮源。

圖2 碳源對鐵載體活性單位的影響Fig.2 Effects of carbon sources on siderphore units

圖3 氮源對鐵載體活性單位的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on siderphore units

圖4 初始碳氮比對鐵載體活性單位的影響Fig.4 Effects of initial carbon-nitrogen ration on siderphore units

其次考察不同的碳氮比對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果見圖4。增加氮源的比例未能明顯地增加V.vulnificusY8菌株的產鐵載體能力;增加碳源的比例時,其產鐵載體能力提高,變化明顯,當碳氮比為3∶1時,鐵載體活性單位達到最高,為76.95%。因此考慮氮源成本因素,確定最適碳氮比范圍為2∶1～4∶1。

2.2.2 最佳初始pH的確定 考察不同的pH條件對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果見圖5。由圖5可知,鐵載體活性單位在酸性條件下比中性和堿性條件下要低,在pH<5.5顯著降低,pH5.5～pH7時鐵載體活性單位緩慢增加,pH7～pH8.5鐵載體活性單位基本達到最大值,保持穩定狀態。而在pH>8.5鐵載體活性單位有明顯下降趨勢,因此pH7～pH8.5時為最佳鐵載體誘導條件。培養基酸性太高,菌體自身無法生長。鄧曦等[20]通過單因素實驗研究表明創傷弧菌在pH6～pH8時生長最佳,本實驗研究發現的最佳鐵載體誘導條件與創傷弧菌生長pH基本上相一致。

圖5 初始pH對鐵載體活性單位的影響Fig.5 Effects of initial pH value on siderphore units

2.2.3 最佳初始鹽度的確定 考察不同的鹽度對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果見圖6。由圖6可知,鐵載體活性單位在鹽度為3%時達到最高,當鹽度為1%～3%時,鐵載體活性單位逐漸增長,高于3%后,鐵載體活性單位顯著下降。創傷弧菌是一種嗜鹽性海洋細菌,生長需要一定的鹽度,在鹽度為0%,創傷弧菌將無法生長。對V.vulnificusY8菌株的嗜鹽性實驗(未發表)發現V.vulnificusY8菌株在TSB培養基生長的最適鹽度為3%。同時在MKB培養基3%鹽度時菌株生長良好,鐵載體活性單位達到最大值。因此確定其鐵載體最佳誘導鹽度為1%～3%。

圖6 初始鹽度對鐵載體活性單位的影響Fig.6 Effects of initial salinity on siderphore units

2.2.4 最佳溫度的確定 考察不同的溫度對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果見圖7。在V.vulnificusY8菌株的最適生長溫度實驗中(未發表)發現當溫度為20～40 ℃時,隨著溫度的升高,V.vulnificusY8菌株生長速率不斷增加,菌株最適生長溫度范圍為35～37 ℃。由圖7可知,在溫度20～35 ℃時,菌株鐵載體活性單位不斷增加;在溫度高于35 ℃時,菌株生長迅速,但鐵載體活性單位并未增加。因此確定最佳鐵載體活性單位溫度為25～35 ℃。

圖7 溫度對鐵載體活性單位的影響Fig.7 Effects of temperature on siderphore units

2.2.5 最佳裝液量的確定 考察不同的裝液量對V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結果見圖8。由圖8可知最佳裝液量為60～100 mL。當裝液量為20～40 mL時,鐵載體活性單位無明顯變化;當裝液量為40～60 mL時,鐵載體活性單位增加。當裝液量60～80 mL,鐵載體活性單位增加緩慢;當裝液量80～120 mL時,鐵載體活性單位逐漸減少。裝液量的高低表示培養基中含氧量的多少,培養基中適當的氧含量有利于創傷弧菌的生長。

圖8 裝液量對鐵載體活性單位的影響Fig.8 Effects of medium capacity on siderphore units

2.3 Plackett-Burman設計法

在單因素實驗的基礎上,確定各水平最佳產鐵載體范圍:確定最佳碳氮比為2∶1～4∶1;最佳鹽度為1%～3%;最佳裝液量為60～100 mL。初始pH為7～8.5,同時考慮乳糖在pH較高時,高溫滅菌時可能發生異構化,因此確定最佳初始pH為7～8;最佳溫度為25～35 ℃,考慮培養基初始培養溫度(未優化前)和正負因子水平,最終確定為28～35 ℃。

利用Plackett-Burman法篩選出最顯著因素,實驗設計及結果見表3。利用Minitab17對表3 數據回歸方程分析,結果表明回歸方程顯著(p=0.001),R2=0.9001表明該模型可信。Plackett-Burman實驗各因素主效應分析如表4所示,顯著性排序為:初始pH>碳氮比>裝液量>溫度>初始鹽度,確定初始pH、碳氮比及裝液量為顯著影響因素。

表3 的Plackett-Burman實驗設計及其響應值表(N=15)Table 3 Experimental design and response value of Plackett-Burman(N=15)

圖9 顯著影響因子對鐵載體活性單位的響應面Fig.9 Response surface methodology of siderphore units by significant factor

表6 響應面回歸模型ANOVA分析結果Table 6 ANOVA for Response Surface Quadratic Model analysis of variance table

注:**表示影響極其顯著,p<0.01;*表示影響顯著,p<0.05。

2.4 三因素三水平的響應面實驗設計

Box-Behnken設計結果分析見表5、表6。該二次模型的多元相關系數R2=0.9987,表明僅有0.13%的變異不能由該模型解釋。對表6構建多元回歸擬合方程,得到初始pH(X1)、裝液量(X2)、最佳碳氮比(X3)與響應值鐵載體活性單位(Y)的關系,其方程式表達為鐵載體活性單位(SU,%)=87.18+13.20X1+1.03X2+0.57X3-0.54X1X2+1.80X1X3+0.85X2X3-9.74X12-4.68X22-14.50X32。

根據回歸方程得出三種顯著影響因素初始pH、碳氮比及裝液量的響應面和等高線結果見圖9。結果表明:初始pH(X1)和裝液量(X2)、裝液量(X2)和最佳碳氮比(X3)交互作用不顯著,初始pH(X1)和最佳碳氮比(X3)交互作用顯著。利用Design-Expert8.0.6分析得到鐵載體活性單位最優條件:初始pH為7.84,裝液量為81.53 mL,最佳碳氮比為3.06∶1,預測鐵載體活性單位(SU)可高達90.7404%?？紤]實際操作,設定初始pH為8,裝液量為82 mL,最佳碳氮比為3∶1。

2.5 驗證實驗

按照DesignExpert8.0.6確定的最佳優化條件,進行三次平行實驗,得到鐵載體活性單位為89.2311%、90.0127%、89.7842%,平均鐵載體活性單位為89.676%,實測值與模型預測值相對誤差為0.752%,說明模型預測效果良好。

3 結論

本文以海水中分離出的5株創傷弧菌為實驗菌株,基于MKB培養基,篩選出其中鐵載體活性單位最高的V.vulnificusY8菌株進行響應面優化并得到最佳誘導條件,同時結合實際優化條件,得到優化條件:分別以乳糖和酵母浸出粉作為碳氮源且碳氮比3、初始pH8及裝液量82 mL。對于MKB培養基,優化前的參數:以甘油和蛋白胨作為碳氮源且碳氮比為1、初始pH6.8～7.0及裝液量100 mL,得出的平均鐵載體活性單位為69.95%。經過優化后的實驗驗證V.vulnificusY8的平均鐵載體活性單位為89.676%,較優化前提高了23.73%。利用響應面法優化創傷弧菌產鐵載體誘導條件,實現了鐵載體的高效誘導,解決了傳統培養基誘導率不高,聯鐵物質毒性大,不利于廣泛使用等問題,為日后的鐵載體進一步研究奠定基礎。

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Screening of siderophore-producingVibriovulnificusand optimization of induction conditions using response surface methodology

YANG Chang-e1,LU Yan-li2,NI Han-cheng1,ZHOU Yong1,NING Xi-bin1，*

(1.Shanghai Engineering Research Center of Acquatic-Processing and Preservation,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Dalian Jinzhou District Fisheries Service station,Liaoning Province,Dalian 116100,China)

Vibriovulnificusis an important pathogen. When eating infected fish,human will suffer from serious disease. To date,many potential virulence factors ofVibriovulnificushave been identified. Among the reported factors,Siderophore is a well-known crucial virulence factor. In this study,the siderophore-producing strains were screened by using MKB(Modified King B)medium which isolated from the seawater. MKB-CAS(Chrome azuorl S)overlay plate method and UV-VIS Spectrophotometer were used for the screening of high yield siderophore-producing strain and detection of SU(siderphore units)respectively.V.vulnificusY8 strain was optimized which had the highest siderophore-producing capacity. The optimization of significant factors on SU including the initial pH,medium capacity and nitrogen ratio(C/N)was determined by response surface methodology. These results indicated that the value of SU was expected to 90.7404% under the optimum condition of initial pH7.84,medium capacity of 81.53 mL and C/N of 3.06. Three parallel verification results indicated that the maximum SU value was consistent with the mean SU value and the optimized SU value was increased by 23.73% compared to the previously measured value. The best optimization conditions was obtained by using response surface methodology which would lay the foundation of the further study in the future.

Vibriovulnificus;Siderophore;MKB medium;response surface methodology

2016-07-26

楊常娥(1990-)，女，碩士研究生， 研究方向：食品微生物,E-mail：18704491561@163.com。

*通訊作者:寧喜斌(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物、食品安全，E-mail：xbning@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建設(11DZ2280300)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0159-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.022