地衣芽孢桿菌BL5產孢發酵條件優化

張莉力,許云賀,肖海蒂,王淋楓,黃 濤,陳文瑩,2,*

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.遵義醫學院公共衛生學院,貴州遵義 563000)

張莉力1,許云賀1,肖海蒂1,王淋楓1,黃 濤1,陳文瑩1,2,*

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.遵義醫學院公共衛生學院,貴州遵義 563000)

地衣芽孢桿菌作為一個益生菌在食品或飼料工業中都具有廣泛的應用前景。本實驗以芽孢數和芽孢率為指標,經Plackett-Burman設計實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗,得到最佳發酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L、Mg2+濃度為1 g/L、接種量5%、種子菌齡12 h,發酵溫度30 ℃、發酵時間為36 h。對確定的最佳發酵條件進行驗證實驗,結果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產芽孢率為94.67%,芽孢數為3.32×109CFU/mL。

地衣芽孢桿菌BL-5,芽孢率,芽孢數,響應面法

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一類益生菌,屬于G+好氧菌[1]。地衣芽孢桿菌因有著良好的適應能力和能產生豐富的酶系,使其長期應用于生產食品工業用的酶制劑。Roy等[2]從印度東北部阿薩姆的土壤樣品中分離到一個嗜堿菌菌株。該菌株能夠在極堿性pH(12.5)條件下生長并產生α-淀粉酶。Rehman等[3]分離的地衣芽孢桿菌KIBGE IB-21具有果膠酶活性。Gurung等[4]通過來自地衣芽孢桿菌DSM 13的UDP葡糖基轉移酶YjiC在體外成功合成了芹菜素糖苷。

此外,地衣芽孢桿菌是一種理想的飼料添加劑,能夠提高腸屏障功能和抑制致病細菌粘附于腸壁,能夠提高牲畜的免疫力和抗病力,提高飼料的利用率,增加牲畜和家禽的生產能力[5-6]。Zhang等[7]研究表明膳食地衣芽孢桿菌水平從0上升到1×107CFU/g,白細胞數量、補體活性以及血清總蛋白、球蛋白含量全部顯著升高。Gobi等[8]研究表明105CFU/mL地衣芽孢桿菌Dahb1能夠通過增強亞洲鯰魚的生長、免疫及抗氧化來抵抗副溶血性弧菌Dahv2感染。Lei等[5]研究表明飼喂含地衣芽孢桿菌(0.01%和 0.03%)的飼料能夠增加雞蛋產量和質量,并且存在劑量依賴關系。地衣芽孢桿菌發揮其作用主要通過降低應激響應、上調生長激素和增進腸道健康來實現。Liu等[9]研究表明膳食補充地衣芽孢桿菌能夠顯著增加肉雞體重,并顯著改善3～6周和0～6周飼養期的飼料轉化率。此外,補充地衣芽孢桿菌也導致蛋白質和游離氨基酸含量的增加,并降低雞胸肉條脂肪含量(p<0.05)。因此地衣芽孢桿菌可作為在肉雞生長促進和肉質增強劑。

因此本文在前期單因素實驗的基礎上,通過響應面實驗對地衣芽孢桿菌BL-5芽孢數及芽孢率的影響因素進行優化,為提高地衣芽孢桿菌BL-5的益生效果提供基礎數據支持,為地衣芽孢桿菌BL-5在食品或飼料工業中的應用奠定基礎。

表1 芽孢率及芽孢數PB設計實驗結果Table 1 The results of the rate and number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌BL-5 錦州醫科大學食品微生物實驗室保存。

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 均為北京奧博星生物技術有限責任公司。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司;UV754PC紫外分光光度計 上海佑科儀表有限公司;DHP-9082型恒溫培養箱 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;DHP-9052型pH計 上海一恒科技有限公司;M4-AL204電子分析天平 蘭州中西儀器有限公司;HZQ-F200振蕩培養箱 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;數碼生物顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;微量移液器 百得實驗室儀器;DK-98-1型水浴鍋 天津泰斯特儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化方法 將凍存于-80 ℃超低溫冰箱中的地衣芽孢桿菌BL-5以2%(體積/體積)接種量接入5 mL種子培養基(牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 L、pH7.0)進行活化,37 ℃下150 r/min搖床培養24 h,傳代培養3次。至活力上升后,接種于斜面培養基(營養瓊脂)上,用于實驗過程中種子菌的制備。

1.2.2 產芽孢菌的篩選 將活化后的保存于斜面上的菌株挑取少許劃線于促芽孢培養基(葡萄糖1.0 g、蛋白胨1.0 g、硫酸銨0.2 g、酵母膏0.7 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、磷酸氫二鉀1.0 g、瓊脂20.0 g(固體培養基時),水1 L,pH7.2)平皿上,30 ℃培養24 h后挑選獨立且大菌落到裝有25 mL無菌生理鹽水中,振蕩均勻后置100 ℃水浴鍋中水浴10 min,再涂布于促進芽孢生長的培養基的平板上進行培養,反復多次。最后挑取平板上大的單菌落轉接到促進芽孢生長培養基的試管斜面上,30 ℃下培養24 h后,轉置于4 ℃冰箱冷藏室保存備用。

1.2.3 芽孢測定方法 芽孢數(b):將培養后的菌液在致死溫度(75 ℃)下處理15 min后,迅速冷卻后采用稀釋梯度平皿計數法統計活菌數;總菌數(a):將培養后的菌液直接進行稀釋梯度平皿計數法統計活菌數[10]。

1.2.4 實驗設計

1.2.4.1 Plackett-Burman設計(PB設計)篩選主要影響因素 在前期對地衣芽孢桿菌BL-5的生長條件優化(固定:蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、pH8.0、轉速150 r/min)[11]基礎及產孢單因素實驗的基礎上,對除了致死溫度和種子培養基(牛肉膏蛋白胨培養基)2個因素以外的6個因素(發酵時間、發酵溫度、接種量、種子菌齡、K+濃度和Mg2+)進行Plackett-Burman設計[12]。運用Minitab軟件將其6種因素進行兩水平實驗設計,每組實驗同時進行3個平行實驗,取均值確立主要影響因素。

1.2.4.2 最陡爬坡實驗確定轉折點 在Plackett-Burman設計實驗確定的三個主要影響因素的結果基礎上,根據三個因素的影響的正負效應,設計出6個實驗,每組實驗同時進行3個平行實驗,取均值分析出其中作為轉折點的一個實驗條件。

1.2.4.3 響應面分析法確定最大響應值 在最陡爬坡的基礎上,確定了一個最高點,然后運用Minitab軟件對三種因素采用Box-Behnken法進行優化,每組實驗同時進行3個平行實驗[13-14]。

1.2.5 統計分析 運用SPSS Statistics17.0軟件進行單因素方差分析,其中兩兩比較采用了SNK方法;Plackett-Burman設計、部分析因設計和響應面Box-Behnken法采用Minitab16.0軟件進行方差分析[15-16]。

2 結果與分析

2.1 PB設計篩選主要影響因素

首先,由表1可知,第8個實驗的芽孢率最佳,能達到93.90%,但以芽孢數為指標比較時,第10個實驗的芽孢數最佳(13.2×108CFU/mL),且芽孢率能達到82.00%。再由圖1和圖2的芽孢率和芽孢數的標準化效應分析可知,芽孢率有發酵時間、K+濃度和Mg2+濃度具有顯著差異,但以芽孢數作為指標統計分析時,6個因素均無顯著差異。此外,從圖1可看出,發酵時間、K+濃度和Mg2+濃度的顯著性影響次序為:發酵時間>K+濃度>Mg2+濃度。以芽孢數為指標時,如圖2所示,并無顯著差異的影響因素。

表2 芽孢率和芽孢數的最陡爬坡實驗設計及結果Table 2 The steepest ascent experimental design and results of the rate and number of spores

注:不同字母之間表示存在顯著差異(p<0.05),同一字母表示不顯著。

在圖1統計結果基礎上,得到發酵時間、K+濃度和Mg2+濃度的主效應圖(圖3),其中發酵時間和Mg2+濃度呈正效應,隨水平的增加芽孢率增加,而K+濃度呈負效應,隨著K+濃度增加,芽孢率反而降低,此主效應圖對下一階段的最陡爬坡實驗選定水平走向有著重要意義。其余沒有顯著影響的條件固定為:發酵溫度30 ℃、接種量5%、種子菌齡12 h。

圖1 芽孢率PB設計的標準化效應分析Fig.1 The standardized effect analysis of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

圖2 芽孢數PB設計的標準化效應分析Fig.2 The standardized effect analysis of the number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

圖3 芽孢率PB設計的主效應圖Fig.3 The main effects plot of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡實驗確定轉折點

根據Plackett-Burman設計實驗中結果可知,其中發酵時間和Mg2+濃度呈正效應,K+濃度呈負效應,在此基礎上調整水平范圍,設計6組實驗,以確定響應面實驗的轉折點,具體實驗結果見表2。

由表2可知,以芽孢率為指標時,第1組、第5組和第6組實驗之間不存在顯著差異,而第2組、第3組和第4組之間也不存在顯著差異,但是第1、5和6組芽孢率顯著低于第2、3和4組,其中第3組的芽孢率最佳,為95.25%。

以芽孢數為指標時,第3組的芽孢數最高,芽孢數達到2.18×108CFU/mL。綜合芽孢率和芽孢數的指標,均為第3組實驗的結果最佳,因此選定第3組的因素水平,即:發酵時間為42 h,K+濃度為0.004 mol/L,Mg2+濃度為1.5 g/L。

2.3 響應面分析法確定最大響應值

以最陡爬坡實驗確定的最佳條件為中心,以芽孢率為主要指標,芽孢數為輔助指標進行進一步Box-Behnken設計的響應面優化實驗。

表3 芽孢率和芽孢數的Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 The Box-Behnken experimental design and results of the rate and number of spores

表4 芽孢率響應面實驗的方差分析Table 4 The variance analysis of the rate of spores in response surface experiment

注:*表示差異“顯著”(p<0.05),**表示差異“極顯著”(p<0.01),表5同。

由表3可知,以芽孢率為指標時,第12組實驗結果為最優,但芽孢數并不是最佳。而以芽孢數為指標時,第5組實驗的實驗結果最佳,芽孢數達3.97×109CFU/mL,且芽孢率能達到99.1%,僅次于第12組實驗中的芽孢率。但運用Minitab 16.0 軟件進行進一步的統計學分析,芽孢數的分析結果如表5所示,模型中回歸和線性p>0.05,均無顯著意義,即:芽孢數既不存在直線回歸關系,也不存在曲線回歸關系,換而言之,芽孢數的統計結果顯示其并無統計學意義。因此,地衣芽孢桿菌BL-5的進一步優化不再以芽孢數作為指標參考。

在芽孢率的響應面實驗結果中(表4),回歸有著極顯著的統計學意義,而線性并無顯著意義,說明芽孢率的響應優化結果是曲線回歸。平方和交互作用均為顯著,尤其是平方極顯著,故芽孢率的響應面實驗可以進行進一步的分析。

通過對運用Minitab 16.0 軟件對地衣芽孢桿菌BL-5的芽孢率進行回歸分析,對實驗數據進行回歸擬合,得到二次回歸方程:

Y=86.533+19.021X12-22.204X22-16.654X32+15.925X2X3

其中:X1-發酵時間;X2-K+濃度;X3-Mg2+濃度。

其中決定系數R2=88.87%,說明這種實驗方法比較可靠,回歸擬合程度較好,可以用此模型對芽孢率進行預測。

根據回歸方程,運用Minitab 16.0 軟件,作出以發酵時間、K+濃度和Mg2+濃度任一一個因素的水平不變,另外兩個因素對芽孢率的影響的響應面曲面圖和等高線圖[17],見圖4。

如圖4所示,當保持Mg2+濃度為1 g/L時,發酵時間和K+濃度對芽孢率的響應面曲線圖呈弧形的弓曲面,等高值線呈雙曲線的規律。另外根據芽孢率在等高值線上的變化,顯示發酵時間和K+濃度并無交互作用,反而呈現各自的平方具有顯著意義。

當保持發酵時間為36 h時,K+濃度和Mg2+濃度對芽孢率的響應面曲線圖呈規則弧形圖,且K+濃度和Mg2+濃度對芽孢率的交互作用隨著K+濃度和Mg2+濃度升高,響應值芽孢率呈現先增大后減小的趨勢,表明兩因素的交互作用顯著。

當保持K+濃度為0.002 mol/L時,發酵時間和Mg2+濃度對芽孢率的響應面曲線圖也是呈弧形的弓曲面,等高值線呈雙曲線的規律。根據芽孢率在等高值線上的變化,表明兩因素并無交互作用,只是各自平方的顯著影響芽孢率。

表5 芽孢數響應面實驗的方差分析Table 5 The variance analysis of the number of spores in response surface experiment

圖4 芽孢率的響應面圖和等高線圖Fig.4 The response surface and contour plots of the rate of spores

最終由Minitab 16.0軟件,以最優芽孢率為目的,進行響應優化的最佳發酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L,Mg2+濃度為1 g/L,發酵時間為36 h。對此優化條件進行驗證實驗,重復3次實驗,結果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產芽孢率平均值為94.67%,芽孢數為3.32×109CFU/mL,優化結果較為理想。因而,可認為基于響應面分析法所得到地衣芽孢桿菌BL-5產芽孢率優化發酵條件參數準確可靠,具有一定的實際應用價值。

3 結論

在前期單因素實驗的基礎上以芽孢率和芽孢數為指標進行優化,經PB實驗設計、最陡爬坡實驗和響應面實驗,得到最佳發酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L、Mg2+濃度為1 g/L、接種量5%、種子菌齡12 h,發酵溫度30 ℃、發酵時間為36 h。對確定的最佳發酵條件進行驗證實驗,結果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產芽孢率平均值為94.67%,芽孢數為3.32×109CFU/mL。

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Optimization of fermentation conditions of spores production ofBacilluslicheniformisBL-5

ZHANG Li-li1,XU Yun-he1,XIAO Hai-di1,WANG Lin-feng1,HUANG Tao1,CHEN Wen-ying1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China;2.School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China)

Bacilluslicheniformis,as one member of probiotics,has broad application prospects in the food and feed industries. According to the number and rate ofBacilluslicheniformisBL-5 spores,the optimal conditions of fermentation was acquired via the Plackett-Burman experimental design,steepest ascent experimental design,and response surface experiment. And the results showed the optimized conditions were K+concentration of 0.002 mol/L,Mg2+concentration of 1 g/L,inoculation amount of 5%,inoculating age of 12 h,fermentation temperature of 30 ℃,fermentation time of 36 h. The optimum condition was verified,the rate and number ofBacilluslicheniformisBL-5 spores were 94.67% and 3.32×109CFU/mL,respectively.

BacilluslicheniformisBL-5;the rate of spores;the number of spores;response surface methodology

2016-08-20

張莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向:微生物,E-mail:lilyzhang1977@163.com。

*通訊作者:陳文瑩(1989-)，女，碩士，研究方向：微生物，E-mail:chenxiaomi1006@163.com

遼寧省自然科學基金項目(2014022046);國家自然科學基金項目(31301499)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.020