耐高溫蛋白酶產生菌的篩選及酶學特性的初步研究

劉喚明,張芷欣,洪鵬志,*,周春霞,楊 萍,陳康健,吳金紅

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,水產品深加工廣東普通高校重點實驗室,廣東湛江 524088；2.廣東省水產品深加工及副產物高值化利用工程技術研究中心,湛江恒興水產科技有限公司,廣東湛江 510300)

耐高溫蛋白酶產生菌的篩選及酶學特性的初步研究

劉喚明1,張芷欣1,洪鵬志1,*,周春霞1,楊 萍1,陳康健2,吳金紅2

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,水產品深加工廣東普通高校重點實驗室,廣東湛江 524088；2.廣東省水產品深加工及副產物高值化利用工程技術研究中心,湛江恒興水產科技有限公司,廣東湛江 510300)

為了提供可用于水產飼料添加劑用途的蛋白酶,從瑪珥湖環境中篩選出耐高溫蛋白酶產生菌株。通過牛奶平板篩選的方法從土壤中分離獲得30株產蛋白酶菌株,并通過搖瓶發酵復篩的方法篩選產酶最高的菌株HL-3,其發酵液的蛋白酶活性高達399.2 U/mL。通過生理生化特征鑒定、16S rDNA基因序列和系統發育分析,初步鑒定菌株HL-3為地衣芽孢桿菌。菌株HL-3所產蛋白酶的最適作用溫度為70 ℃,最適pH為7.0,在90 ℃保溫10 min 后酶活力仍可保留75.12%。在離子濃度為 1.0×10-3mol/L 時,Cu2+和Mn2+對該酶有較強的抑制作用,Fe2+、Zn2+、Ca2+對該酶有激活作用,Mg2+和K+對該酶活性幾乎沒有影響。預期該菌株產的蛋白酶具有用于水產飼料添加劑的潛力。

耐高溫蛋白酶,地衣芽孢桿菌,瑪珥湖

酶制劑可降解飼料中的抗營養因子,提高營養物質的消化利用率,對于高效環保飼料的研制生產具有積極的指導意義。近年來,由于魚粉資源的緊缺和價格的上漲,植物蛋白源在水產飼料配方的比例逐漸增大。然而與魚粉相比,植物蛋白源通常具蛋白質消化率低,含有多種抗營養因子等缺點[1],會對動物生長性能產生不利影響。因而,近年來有關水產飼料中飼用酶制劑的研究成為研究熱點。研究表明,水產飼料中添加蛋白酶可促進水產動物的生長性能[2-3],特別是在植物蛋白源用量比例大的水產飼料中[2]。目前大多數飼用酶在飼料中多以干粉粒的形式在飼料加工、調制和制粒之前添加,然而飼料制粒是一個高溫、高濕過程,絕大多數生物酶的熱穩定性很差,在高溫制粒時很容易失活[4],因而水產飼料中更需要的是耐高溫的蛋白酶。

耐高溫蛋白酶具有較好的耐熱性,在工業與食品加工方面都有著更為廣闊的應用前景,已成為國內外酶研究領域的熱點。目前已發現的耐高溫蛋白酶生產菌株有嗜熱脂肪芽孢桿菌[5]、嗜熱芽孢桿菌[6]、熒光假單孢桿菌[7]和蘇云金芽孢桿菌[8]等。然而,不同來源的耐高溫蛋白酶的酶學特性存在較大的差異[9]。用于不同領域的耐高溫蛋白酶對其酶學性質有著不同的要求。盡管目前已發現了許多耐高溫蛋白酶產生菌,但其酶學特性適合應用于水產飼料添加劑用途的耐高溫蛋白酶產生菌株還尚未有研究報道。

湛江市湖光巖瑪珥湖是世界上最大的瑪珥湖,它是距今15萬年前火山爆發后,火山口洼地積水而成,周圍被火山碎屑環包圍。目前,已經有從瑪珥湖環境中篩選出耐高溫微生物的研究報道[10]。本課題組依托地域優勢,從湛江湖光巖土壤中篩選出產耐高溫蛋白酶的菌株,并對該菌的酶學特性進行研究,為其應用于水產飼料添加劑提供基礎資料與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣 采自湛江市湖光巖風景區瑪珥湖附近,用無菌刮鏟采集離地面10 cm左右的土樣,放在玻璃瓶中于4 ℃保存。

福林酚試劑 購于北京鼎國生物技術發展中心;細菌基因組DNA小量純化試劑盒 購于碧云天生物技術研究所;脫脂奶粉 購買于內蒙古伊利實業集團股份有限公司;豆粕 購買于中紡糧油(湛江)有限公司。

分離培養基:脫脂奶粉10 g,瓊脂2 g,水100 mL,100 ℃滅菌10 min。

斜面培養基:牛肉膏5 g,氯化鈉5 g,蛋白胨 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2,121 ℃滅菌20 min。

發酵初篩發酵培養基:豆粕10 g,葡萄糖0.5 g,蒸餾水100 mL,121 ℃滅菌20 min。

SPX-250B生化培養箱 上海博訊實業有限公司;HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;CF16RX低溫離心機 日本日立公司;LabCycler溫度梯度PCR儀 德國SensoQuest;DYY-12電泳儀 北京市六一儀器廠;Multiskan MK3酶標儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 耐高溫蛋白酶產生菌的篩選

稱取土樣10.0 g,放入250 mL錐形瓶中,加入90 mL無菌水,震蕩均勻后于沸水浴煮沸5 min。取蒸煮后的懸濁液進行十倍梯度稀釋依次制得10-1～10-55個濃度,從10-3、10-4、10-5這三個梯度中各吸取100 μL稀釋液均勻涂布于分離培養基平板,于50 ℃培養箱中培養12 h。觀察菌體周圍生長圈的大小,記錄透明圈直徑(D)與菌落直徑(d),計算兩者的比值,選取D/d較大的菌落菌株轉接到斜面培養基保存。將初篩挑選的菌株挑取一環接種至液體發酵培養基中,裝液量為30 mL/250 mL,于50 ℃、150 r/min振蕩培養6 h后測定發酵液的酶活。

1.3 蛋白酶酶活的測定

蛋白酶酶活力的測定:采用福林(Folin)法,按參照文獻[11]進行,用pH4～pH10 的緩沖液,反應溫度為50 ℃。酶活單位定義:1 mL酶液在特定條件下每分鐘水解酪蛋白溶液生成1 μg酪氨酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位U。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 生理生化實驗方法 根據《伯杰氏細菌鑒定手冊(第九版)》[12]并參考《常見細菌系統鑒定手冊》[13]的部分方法對所篩選出的菌株進行鑒定。

1.4.2 16S rDNA序列分析 對三角瓶發酵復篩所得的菌株測定其16S rDNA基因序列以進行菌株鑒定。通過李欣[14]等的方法擴增菌株的16S rDNA,擴增成功的PCR產物送至上海生工公司進行測序,獲得的測序結果遞交GenBank數據庫中Blast比對,進行相似同源性分析,Maximum likelihood法繪制系統發育樹,BOOTSTRAP分析法,選取重復1000評估樹的準確性。

1.5 酶學特性研究

1.5.1 pH對酶活性的影響 配制pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的緩沖液,以不同pH緩沖液配制0.5%酪蛋白底物,按照上述酶活性測定方法,測定酶液在不同pH條件下的酶活。以酶活力最高時為100%,計算其他條件下的相對酶活力。

1.5.2 溫度對酶活性的影響 以最適pH緩沖液配制濃度為0.5%酪蛋白底物,按照酶活性測定方法測定酶液在不同溫度下的酶活,以確定酶液的最適反應溫度。以酶活力最高時為100%,計算其他條件下的相對酶活力。

1.5.3 酶的熱穩定性 各取1 mL酶液分別放入50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋中保溫10 min,然后在最適pH和最適溫度下測定酶活性,以未處理酶液的酶活為100%,計算相對酶活。

1.5.4 金屬離子對酶活性的影響 按酶活的測定方法,測定終濃度為1.0×10-3mol/L的Fe2+、Mg2+、K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Ca2+對蛋白酶酶活性的影響,對照反應體系中不加任何化合物,以對照酶活為100%,計算相對酶活。

圖1 菌株HL-3的系統發育樹Fig.1 The phylogenetic tree of the strain HL-3

1.6 數據統計分析

本文中所有實驗均平行3次。所有數據均以平均值(mean)±標準差(SD)表示。運用SAS 8.0軟件統計,采用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性差異分析(p<0.05)。數據圖由Origin 8.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 耐高溫蛋白酶產生菌株的篩選

從不同土樣中分離純化出30株在篩選培養基上能形成蛋白質水解圈的微生物菌株。選出6株透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值大于5的菌株發酵培養16 h后,測定發酵液酶活,見表1。綜合D/d值和酶活兩個因素,選擇HL-3作為出發菌株,進行后續研究。

表1 耐高溫蛋白酶產生菌篩選結果Table 1 Result of screening strains producing thermostable protease

2.2 菌種鑒定

2.2.1 生理生化鑒定 菌株HL-3生理生化測定結果如表2所示。由表2結果可知,菌株HL-3的部分生理生化特征為:接觸酶實驗、厭氧生長、VP實驗、葡萄糖產酸、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、硝酸鹽還原和7%NaCl耐受實驗均為陽性;葡萄糖產氣、酪氨酸水解和吲哚實驗都為陰性。通過查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》,將菌株HL-3初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

表2 菌株HL-3的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strain HL-3

注:“+”為陽性,“-”為陰性。

2.2.2 16S rDNA同源性比較 將菌株HL-3的測序結果,通過NCBI進行16S rDNA數據庫BLAST,HL-3與標準菌株BacilluslicheniformisATCC14580的相似性最高,高達99.6%。選取序列相似度達 99% 的部分菌種,采用軟件Mega5.05,Maximum likelihood法制作系統發育樹,結果見圖1。由圖1結果可知,菌株 HL-3在系統發育樹上與BacilluslicheniformisATCC14580在同一支系。綜合以上分析,可初步鑒定菌株HL-3為地衣芽孢桿菌。

2.3 酶學特性的研究

2.3.1 pH對酶活性的影響 不同 pH緩沖液條件下測定的發酵液的蛋白酶活力結果(圖2),結果表明,該蛋白酶的最適反應pH為7.0,是一種中性蛋白酶。對于無胃或是消化道偏中性的水產動物來說,需要的是中性飼用酶制劑[15],因而HL-3菌株產蛋白酶具有應用于水產飼料添加劑的潛力。

圖2 pH對蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of pH on protease activity

2.3.2 溫度對酶活性的影響 圖3顯示了不同反應溫度條件下測定發酵液蛋白酶活力。結果表明,該蛋白酶的最適反應溫度為70 ℃,蛋白酶活力在60～90 ℃仍可保持一定的酶活性,90 ℃下可保持最高酶活的60.13%活性,可見該蛋白酶具有較強的耐熱性,是一種耐高溫的蛋白酶。

圖3 溫度對蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on protease activity

2.3.3 蛋白酶的熱穩定性 發酵液在不同溫度水浴后,測得的蛋白酶酶活如圖4所示。結果表明:溫度低于70 ℃的條件下水浴保溫10 min,蛋白酶的酶活基本不變;溫度高于70 ℃的條件下水浴保溫10 min,蛋白酶的酶活雖開始下降,但是經過90 ℃水浴保溫10 min的處理,發酵液蛋白酶的酶活仍保留75.12%,顯示該蛋白酶具有良好的熱穩定性。

圖4 蛋白酶的熱穩定性Fig.4 The thermo-stability of the protease

2.3.4 金屬離子對酶活的影響 圖5顯示了在不同金屬離子存在下的蛋白酶的酶活。由圖4結果可知:在離子濃度為 1.0×10-3mol/L 時,Cu2+和Mn2+對該酶有較強的抑制作用,其中Cu2+抑制作用最強,可使蛋白酶活性降低21.25%;Fe2+、Zn2+、Ca2+對該酶有激活作用,其中Fe2+激活作用最強,可使其活性增強30.52%;Mg2+和K+對該酶活性幾乎沒有影響。

圖5 金屬離子對蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on protease activity

3 討論與結論

飼用蛋白酶既要求酶的最適反應溫度與動物消化道生理條件相近,又要有一定的熱穩定性,以便于飼料制粒和儲存。宋鵬[16]等從土壤中篩選出枯草芽孢桿菌,該菌所產的中性蛋白酶經過70 ℃保溫10 min后酶活力全部喪失。李鐵晶[17]等從發酵豆醬中篩選出芽孢桿菌,該菌所產的蛋白酶經過70 ℃保溫10 min后酶活力全部喪失。以上篩選出的常溫型菌種所產蛋白酶熱穩定性差,因此沒有用于飼料制粒加工的可能性。本實驗條件下,篩選出的耐高溫地芽孢桿菌HL-3所產蛋白酶在90 ℃保溫10 min仍保有較高的酶活,說明此菌株所產蛋白酶具有用于飼料工業的潛力。

本實驗從湛江湖光巖土壤中分離出產耐高溫蛋白酶酶活較高的HL-3菌株,初步鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌,經初步液體發酵蛋白酶活性高達399.2 U/mL。同時對該菌株所產蛋白酶的酶學性質進行了研究,結果表明,該蛋白酶的最適作用溫度為 70 ℃,最適pH為7.0;在90 ℃保溫10 min后酶活力仍可保持75.12%。在離子濃度為1.0×10-3mol/L時,Cu2+和Mn2+對該酶有較強的抑制作用,Fe2+、Zn2+、Ca2+對該酶有激活作用,Mg2+和K+對該酶活性幾乎沒有影響。預期該菌株產的蛋白酶具有用于水產飼料添加劑的潛力。

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Isolation of microbial strain producing thermostable protease and characterization of the enzyme

LIU Huan-ming1,ZHANG Zhi-xin1,HONG Peng-zhi1，*,ZHOU Chun-xia1,YANG Ping1,CHEN Kang-jian2,WU Jin-hong2

(1.College of Food Science and Technology,Aquatic Product Processing and Safety Key Lab of Guangdong Province,Key Lab of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2. Guangdong Engineering Research Center for Advanced Processing of Aquatic Product and High-value Utilization of Byproduct,Zhanjiang Hengxing Aquatic Technology Limited Company,Zhanjiang 510300,China)

In order to provide protease for potential use in aquaculture feed industry,the strain producing thermostable protease was screened from the environment of maar lake.Thirty strains were isolated from soil by milk plates. Strain HL-3,which showed the highest production,was screened according to fermenting in shaking flasks,and the enzymatic activity of protease in culture solution of HL-3 was 399.2 U/mL. Based on physiological and biochemical identification,16S rDNA sequence and phylogenetic analysis,the strain HL-3 was preliminarily identified asBacilluslicheniformis. The protease activity preformed optimally at 70 ℃ and pH7.0. The protease retained 75.12% of its original activity after incubation for 10 min at 90 ℃. When ion concentration reached 1.0×10-3mol/L,metal ions of Cu2+and Mn2+would strongly inhibit the protease activity,metal ions of Fe2+,Zn2+and Ca2+would activate the protease activity,metal ions of Mg2+and K+would not affect the protease activity. The protease produced by strain HL-3 in this study may have the potential in aquaculture feed industry.

thermostable protease;Bacilluslicheniformis;maar lake

2016-08-22

劉喚明(1978-),男,碩士,副教授,研究方向:水產品加工,E-mail:lhmgdhydx@sina.com。

*通訊作者:洪鵬志(1965-),男,碩士,教授,研究方向:水產品加工,E-mail:hongpengzhi@sohu.com。

廣東省科技計劃項目(2016A090922015);湛江市科技計劃項目(2015A01004);廣東海洋大學創新強校工程科研項目(GDOU2013050204;GDOU2013050313;GDOU2014050203);廣東省大學生創新實驗項目(201510566049);廣東海洋大學大學生創新訓練項目(CXXL2015045)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0133-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.017