高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜測定替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量

周長朋，王東武，許 潔，鄭文鳳，梁曉艷

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術中心，山東 威海 264205)

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜測定替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量

周長朋*，王東武，許 潔，鄭文鳳，梁曉艷

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術中心，山東 威海 264205)

建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)測定替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量的分析方法。替米沙坦藥物以水-乙腈(80∶20，體積比)溶解后，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)進行分離，以0.1%(體積分數(shù))甲酸水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)掃描方式下選擇離子監(jiān)測(SRM)模式對樣品進行檢測。結(jié)果表明，N-甲基鄰苯二胺在2.0～50 μg/L 范圍內(nèi)線性關系良好(r>0.99)，檢出限(S/N=3)為0.5 μg/L ，定量下限(S/N=10)為2.0 μg/L。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于替米沙坦中N-甲基鄰苯二胺殘留量的測定。

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀；N-甲基鄰苯二胺；替米沙坦

替米沙坦(Telmisartan)是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體(AT1型)拮抗劑，其化學名為4-{[2-正丙基-4-甲基-6-(1-甲基苯并咪唑-2-基)苯并咪唑-1-基]甲基}聯(lián)苯基-2-羧酸(合成路線見圖1)，具有激動過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)及顯著改善血管內(nèi)皮功能的作用，且能抑制血管平滑肌(VSMC)收縮和增殖，是目前較為常用的抗高血壓藥物[1-3]。

N-甲基鄰苯二胺是替米沙坦合成的起始物料，具有1個苯胺結(jié)構，且有一定的致癌毒性，依照歐洲基因毒性雜質(zhì)的指導原則其應屬于潛在基因毒性雜質(zhì)[4]，必須進行嚴密的控制。參照歐洲EMEA提出的采用“毒理學關注閾值”(Threshold of toxicological concern，TTC)作為基因毒性雜質(zhì)可接受限度的計算方法[5]，N-甲基鄰苯二胺的限度為5.0 mg/L，若以替米沙坦的配制濃度為1.0 mg/mL計算，則實際檢測濃度應為5.0 μg/L，對檢測水平的要求較高。目前針對鄰苯二胺的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]、熒光光譜滴定法[8]、化學發(fā)光法[9]等，上述方法的檢出限均較高。而對于藥物中基因毒雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺的研究相對較少，其中王金朝等[10]利用液相色譜法檢測了替米沙坦中的N-甲基鄰苯二胺殘留，但其檢出限為40 ng/mL，難以滿足當前的限度要求。而國外已有多篇文獻報道利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測藥物中基因毒雜質(zhì)[11-12]，國內(nèi)也有利用氣質(zhì)聯(lián)用儀[13-14]、液質(zhì)聯(lián)用儀[15-16]等監(jiān)控基因毒性雜質(zhì)的方法報道，但對于N-甲基鄰苯二胺的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法尚未見報道。

圖1 替米沙坦的合成路線圖Fig.1 Graphical synthetic routes of telmisartan

四極桿-線性離子阱(QTRAP-MS/MS)質(zhì)譜儀是一種混合型串聯(lián)質(zhì)譜，具有與傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀相當?shù)亩抗δ埽异`敏度和特異性均較高，現(xiàn)已廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境等領域[17-22]。本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術，建立了測定替米沙坦藥物中基因毒性雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺的分析方法。該方法操作簡單、回收率好、靈敏度高，填補了國內(nèi)替米沙坦藥物N-甲基鄰苯二胺定量檢測研究的空白，有利于對替米沙坦藥物合成過程中的質(zhì)量參數(shù)進行有效監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源；超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司)；BT-25S精密分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司 )；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；0.22 μm有機系濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)。

N-甲基鄰苯二胺鹽酸鹽(純度≥99%，購自Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(優(yōu)級純，天津大茂化學試劑廠)；實驗用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·m)；替米沙坦精品(迪沙藥業(yè)集團有限公司)。

1.2 溶液的制備

對照品溶液：取N-甲基鄰苯二胺鹽酸鹽適量，精密稱定，至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解，用乙腈定容至刻度，配制成含N-甲基鄰苯二胺1.0 g/L的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。取適量標準儲備液，用乙腈配制成10.0 mg/L的標準中間液，作為對照品溶液，于4 ℃避光保存。上機前用水-乙腈(體積比80∶20)稀釋成相應濃度，過0.22 μm濾膜后注入質(zhì)譜。

供試品溶液：取替米沙坦精品約10 mg，精密稱定，至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后，再加入水-乙腈(80∶20)定容至刻度，過0.22 μm濾膜后注入質(zhì)譜。

1.3 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：A為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0～ 2.00 min，20% B；2.00～4.00 min，20%～95% B；4.00～9.00 min，95% B；9.01～15.00 min，20% B；柱溫35 ℃；進樣體積為10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇離子檢測(SRM)；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 L/min；輔助氣：15 L/min；毛細管電壓：3 500 V；定量方式：外標法定量；定量離子對：m/z123.1/107.6，碰撞能量(CE)：35 V。

圖2 N-甲基鄰苯二胺(5.0 μg/L)在不同配制溶液中的降解曲線Fig.2 Degradation curve of N-methyl-o-phenylenediaie(5.0 μg/L)in different solution

2 結(jié)果與討論

2.1 配制溶液的選擇

N-甲基鄰苯二胺含有1個氨基，溶解后呈弱堿性，在酸性環(huán)境下易發(fā)生降解。因此，本研究考察了不同配制溶液對N-甲基鄰苯二胺降解速度的影響，分別采用初始流動相(0.1%甲酸水溶液-乙腈，80∶20)、水、乙腈和水-乙腈(80∶20)配制濃度為5.0 μg/L的N-甲基鄰苯二胺對照品溶液，放置0，0.1，0.2，0.5，1，2，4 h后上機檢測，發(fā)現(xiàn)N-甲基鄰苯二胺在0.1%甲酸水溶液-乙腈中的降解速度較快，降解幅度較大，而在水、乙腈和水-乙腈(80∶20)中的降解速度較慢，降解幅度較小(見圖2)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦在水中的溶解度非常差，不利于供試品溶液的配制；乙腈對替米沙坦的溶解性雖較好，但配制后N-甲基鄰苯二胺和替米沙坦主峰的峰形均不好，而采用水-乙腈溶液(80∶20)配制后的峰形較好，替米沙坦的溶解度也較好，保證了樣品與對照品配制溶液的一致性，故本文選用水-乙腈溶液(80∶20)作為N-甲基鄰苯二胺標準溶液和替米沙坦供試液的配制溶液。

2.2 色譜條件的選擇

N-甲基鄰苯二胺的極性非常大，出峰時間較早，而替米沙坦的極性偏小，出峰相對較晚，二者的分離難度不大，且N-甲基鄰苯二胺在主峰之前出峰，基本不受替米沙坦的干擾影響。本文在相近的色譜條件下，考察了Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)、Thermo Hypersil-C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)和Agilent Extend-C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm) 3種色譜柱的分離情況。結(jié)果顯示，上述3種色譜柱均能實現(xiàn)替米沙坦主峰和N-甲基鄰苯二胺的有效分離，且N-甲基鄰苯二胺的質(zhì)譜峰形也較好。但考慮到Thermo Hypersil-C18和Agilent Extend-C18色譜柱的柱容量均較小，檢測的進樣量為10 μL，多次進樣后易殘留替米沙坦，影響檢測結(jié)果。而Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱的內(nèi)徑為3.5 μm，柱容量較大，主峰基本不會殘留，故本文選用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱進行分離。

圖3 N-甲基鄰苯二胺標準的SRM色譜圖Fig.3 SRM chromatogram of N-methyl-o-phenylenediamine

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

采用電噴霧離子源，在正離子模式下，對1.0 mg/L的N-甲基鄰苯二胺標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子[M+H]+峰(m/z123.1)；對分子離子峰進行碎裂并掃描子離子，得到二級質(zhì)譜圖，篩選響應值較高、基線噪音低的離子(m/z107.6)作為監(jiān)測離子。采用選擇反應檢測(SRM)模式采集數(shù)據(jù)，駐留時間設定在100 ms，優(yōu)化各離子的碰撞能，得到最佳質(zhì)譜條件如“1.4”所述。在優(yōu)化條件下，得N-甲基鄰苯二胺標準的SRM色譜圖(圖3)。

2.4 方法的線性范圍、檢出限及定量下限

以水-乙腈(80∶20)配制0.0，2.0，5.0，10，20，50 μg/L的N-甲基鄰苯二胺標準系列溶液分別進行測定，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸計算。結(jié)果表明，N-甲基鄰苯二胺在0.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好(r>0.99)；以質(zhì)譜3倍基線噪音計算檢出限(S/N=3)為0.50 μg/L，以質(zhì)譜10倍基線噪音計算定量下限(S/N=10)為2.0 μg/L，完全滿足依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導原則計算的5.0 μg/L濃度的雜質(zhì)限度。

2.5 回收率實驗

采用不含N-甲基鄰苯二胺的替米沙坦精品為空白基質(zhì)，進行不同濃度的加標回收實驗時發(fā)現(xiàn)，各加標濃度下的回收率均較低；且在精密度試驗時發(fā)現(xiàn)，隨著檢測時間的延長回收率逐漸降低，可能是N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中發(fā)生了降解。研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦具有羧酸結(jié)構，其樣品溶液呈弱酸性，而N-甲基鄰苯二胺在酸性條件下會發(fā)生降解。進一步做降解試驗發(fā)現(xiàn)，N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中呈明顯的降解趨勢，但降解的速率較慢(見表1)，不同濃度的N-甲基鄰苯二胺在1 h內(nèi)的降解率均不超過5%，若能在添加實驗時現(xiàn)配現(xiàn)測，基本不會影響回收率效果。本文也嘗試將替米沙坦溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，回收率可得到明顯改善，但操作較為繁瑣，且相應的對照品溶液也需調(diào)節(jié)pH值，不利于實際操作。因此，本文采用不含N-甲基鄰苯二胺的替米沙坦精品為空白基質(zhì)，添加了80%限度、100%限度、120%限度濃度的N-甲基鄰苯二胺分別做回收率和精密度試驗，每個濃度設3個平行，且所有添加樣品均在溶液配制1 h內(nèi)進行檢測，得到平均回收率為85.7%～94.3%，相對標準偏差(RSD)為1.9%～2.9%(見表2)，表明方法的回收率良好，完全可以滿足檢測要求。

表1 不同添加濃度的N-甲基鄰苯二胺在替米沙坦溶液中的降解率Table 1 Degradation rate of N-methyl-o-phenylenediaine in telmisartan at different spiked levels /%

*degradation rate =(CA-CF)/CA×100%，CA：added of N-methyl-o-phenylenediaine，CF：founded of N-methyl-o-phenyl-enediaine at different time points

表2 替米沙坦中添加N-甲基鄰苯二胺的回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs of N-methyl-o-phenylenediamine in telmisartan

圖4 替米沙坦成品中含N-甲基鄰苯二胺的陽性樣品色譜圖(151104A2Y)Fig.4 Chromatogram of positive samples with N-methyl-o-pheny-lenediamine in telmisartan(151104A2Y)

2.6 實際應用

將所建方法應用于檢測合成的藥物小試3批、中試3批及工藝驗證3批共27份樣品，所有樣品均在配制1 h內(nèi)檢測，共檢出6批含有N-甲基鄰苯二胺殘留，檢出結(jié)果分別為2.60 mg/kg(151216A2J)，3.21 mg/kg(151216B1J)，49.42 mg/kg(151216B1Y)，12.30 mg/kg(151104A2Y)，6.46 mg/kg(151104B2Y)，7.73 mg/kg(151104B3Y)，其中有4批樣品超過限度要求，其他樣品均未檢出，151104A2Y陽性樣品譜圖見圖4。

3 結(jié) 論

本文首次建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜測定替米沙坦藥物中基因毒性雜質(zhì)N-甲基鄰苯二胺殘留量的分析方法。該方法靈敏度高、分離度好，回收率、精密度及定量下限均能滿足基因毒性雜質(zhì)的限度要求，是檢測替米沙坦藥物中N-甲基鄰苯二胺殘留量的有效方法。將所建方法用于檢測合成的替米沙坦藥物樣品，共檢出6批含有N-甲基鄰苯二胺殘留，方法有效地指導了替米沙坦合成反應的進行，并為項目的研發(fā)過程起到了良好的監(jiān)督作用。

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Determination of N-Methyl-o-phenylenediamine in Telmisartan by HPLC-QTRAP-MS/MS

ZHOU Chang-peng*，WANG Dong-wu，XU Jie，ZHENG Wen-feng，LIANG Xiao-yan

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai 264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the determination of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.After extracted with water-acetonitrile(80∶20，by volume)，the telmisartan samples were separated on an Agilent Eclipse XDB-C18column(3.5 μm,2.1 mm×100 mm) with a mobile phase of 0.1% formic acid solution-acetonitrile.The electrospray was operated in the positive mode and the samples were monitored under the select reaction monitoring(SRM) mode.As a result，the calibration curves of N-Methyl-o-phenylenediamine showed a good linearity(r>0.99) in the range of 2.0-50 μg/L.The limits of detection(S/N=3) was 0.5 μg/L ，and the limits of quantitation(S/N=10) was 2.0 μg/L.The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good reproducibility，and could be used for the detection of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS)；N-methyl-o-phenylenediamine；telmisartan

2016-09-09；

2016-09-28

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.019

O657.63；TQ460.726

A

1004-4957(2017)02-0262-05

*通訊作者：周長朋，工程師，研究方向：理化檢測及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：20019568@qq.com