一種強陰離子交換樹脂的制備及用于蜂蜜中喹諾酮類藥物的富集檢測

張田麗，胡 坪，曲芳慧，王月榮，章弘揚

(華東理工大學 化學與分子工程學院 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

一種強陰離子交換樹脂的制備及用于蜂蜜中喹諾酮類藥物的富集檢測

張田麗，胡 坪，曲芳慧，王月榮*，章弘揚*

(華東理工大學 化學與分子工程學院 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

采用沉淀聚合法，合成了對氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(VBC-DVB)，并通過與三甲胺修飾反應，獲得了一種含季銨基團的強陰離子交換樹脂(SAX)。表征結果顯示，樹脂是呈單分散形態的微球，平均粒徑為(3.8±1.5) μm，且具有較高的離子交換容量(0.83 meq/g)及良好的選擇性吸附性能，對5種喹諾酮類藥物(諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、加替沙星、司帕沙星)的飽和吸附容量明顯高于同類型商品化Oasis MAX固相萃取柱。將其用于蜂蜜樣品中5種喹諾酮藥物的選擇性富集和HPLC分析。結果顯示，該方法在一定范圍內線性關系良好(r2≥0.998 9)，平均加標回收率為86.8%～120.3%，日內重復性RSD不大于7.0%，日間RSD不大于8.5%。研究結果表明，所制備的SAX材料可用于復雜基質中喹諾酮類藥物殘留的高效前處理分析。

強陰離子交換；三甲胺修飾；固相萃取；蜂蜜；喹諾酮類藥物；HPLC分析

陰離子交換樹脂在環境廢水處理[1]、蛋白質的分離純化[2]、食品安全[3]以及金屬離子檢測[4-5]等方面，有著廣泛的應用。傳統方法制備陰離子交換樹脂，主要是將苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(ST-DVB)進行氯甲基化，再通過胺化反應獲得[6]。但是，在氯甲基化過程中使用的氯甲醚、二氯甲醚等試劑具有較強的致癌性[7]，因此該方法在一定程度上受到限制。為此，本文在Ezzeldin等[8]研究的基礎上，采用沉淀聚合法將對氯甲基苯乙烯(VBC)和二乙烯基苯(DVB)作為反應原料合成共聚物，再以三甲胺為修飾試劑進行胺化反應，得到一種強陰離子交換樹脂(SAX)。該制備方法不僅避免了氯甲醚等致癌性試劑的使用，且胺化反應時間縮短至文獻方法[8]用時的1/4，用料安全，步驟簡單。

喹諾酮是一類合成抗生素類藥物，作為預防和治療藥物普遍用于動物飼養中[9]。為了預防和治療蜜蜂下痢病，蜂農們常在飼料中添加喹諾酮類藥物，因此蜂蜜中喹諾酮類藥物的殘留已引起普遍關注[10]。目前，蜂蜜中喹諾酮類藥物的檢測較多采用HPLC-FLD[11-12]及LC-MS/MS[13]進行測定。雖然這些方法靈敏度高(主要依賴儀器)，但其前處理分析大多使用溶液提取結合Oasis HLB柱[14-15]進行凈化，這些步驟的選擇性和除雜富集效果還有待提高。本研究在成功制備出SAX材料的基礎上，將其作為固相萃取填料，用于蜂蜜樣品中喹諾酮類藥物(諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、加替沙星、司帕沙星)的選擇性富集和HPLC分析，從而為復雜基質中該類藥物殘留的檢測提供了新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省鞏義市予華儀器有限責任公司)；TDL-5A臺式離心機(江蘇省無錫市瑞江分析儀器有限公司)；DZX-3真空干燥箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；GZX-9140 MBE數顯鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)；PB1501-N精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；EPED-E2-10TF實驗室超純水機(南京易普易達科技發展有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；Nicolet 380紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；JSM-6360LV掃描電子顯微鏡(日本日立S-3400N公司)；ASAP 2020全自動比表面積及微孔物理吸附分析儀(美國麥克默瑞提克有限公司)；激光粒度分析儀(珠海歐美克儀器有限公司)；12位固相萃取裝置，0.22 μm微孔濾膜(日本島津技邇公司)；DC-12氮吹儀(上海安譜科學儀器有限公司)；振動渦旋混合器(江蘇省金壇市醫療設備廠)；固相萃取空柱管及篩板(上海德里安儀器有限公司)；Oasis MAX固相萃取柱(美國Waters公司)；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)。

中性氧化鋁(200～300目)、無水三氯化鐵、氫氧化鈉、硝基甲烷、甲醇(上海國藥集團化學試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)、甲苯、丙酮、乙醚、1,2-二氯乙烷(DCE)、硝酸、甲酸、氨水(上海凌峰化學試劑有限公司)；對氯甲基苯乙烯(VBC，90%，日本TCI公司)；二乙烯基苯(DVB,80%)、尿酸(上海阿拉丁試劑公司)；乙腈(HPLC級，德國Merck公司)；硫氰酸銨(湖州市菱湖食品化工廠)；三甲胺水溶液(33%)、安替比林(99%)、諾氟沙星(98%)(上海麥克林生化科技有限公司)；環丙沙星(98%，北京百靈威科技有限公司)；洛美沙星(>98%)、加替沙星(>99%)(上海思域化工科技有限公司)；司帕沙星(99%，上海薩恩化學技術有限公司)；蜂蜜樣品(宜春市景福實業有限公司)。

1.2 SAX樹脂的制備

在裝有球形冷凝管、氮氣保護裝置和磁力攪拌裝置的三口圓底燒瓶(1 000 mL)中加入800 mL乙腈，冰浴條件下依次加入12 g VBC，4 g DVB和0.464 g AIBN。溫度從室溫緩慢升至60 ℃，并保持在該溫度繼續反應46 h。反應結束后，冷卻至室溫，離心過濾，濾餅依次用甲醇、甲苯和丙酮超聲洗滌，40 ℃真空干燥，得共聚物的母體微球(Precursor particles,PP)[16]。

在250 mL三口圓底燒瓶中加入3 g PP微粒和30 mL DCE，在氮氣氛圍下使PP微粒充分溶脹，滴加30 mL三甲胺溶液，以無水三氯化鐵作為催化劑，磁力攪拌下快速升溫至80 ℃，并保持在該溫度反應24 h[1,8]。反應結束后，冷卻至室溫，離心過濾，濾餅先用甲醇超聲洗滌，再用硝酸溶液(pH 1.0)洗滌至上清液用硫氰酸銨檢測不變紅為止。隨后以丙酮為提取劑，再用索氏提取器回流提取12 h。依次用甲醇和乙醚超聲洗滌，真空干燥得SAX微粒。三甲胺修飾的SAX樹脂的合成過程如圖1所示。稱取60 mg上述SAX微粒，用甲醇分散，均勻緊密地裝填于3 mL固相萃取空柱管中，制得60 mg/3 mL固相萃取柱。

圖1 陰離子交換樹脂的合成過程Fig.1 Synthetic procedure of the SAX particles

1.3 吸附性能考察

1.3.1 吸附選擇性考察 將弱酸性物質(尿酸)、兩性物質(洛美沙星、司帕沙星)和堿性物質(安替比林) 4種標樣，配制成濃度為10 μg/mL的混合標準溶液。取1 mL混合標液上樣，依次用3 mL 5%氨化甲醇和3 mL甲醇淋洗，再用3 mL 10%甲酸-甲醇溶液洗脫。將收集的上樣液過濾后，直接進行HPLC分析；將淋洗液及洗脫液氮吹濃縮至干，用500 μL 0.1%甲酸水溶液復溶，過濾后進行HPLC分析。根據相應的色譜峰面積比，分別計算目標物在SAX和Oasis MAX柱上各步萃取過程中的回收率。

1.3.2 飽和吸附容量測定 取諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、加替沙星和司帕沙星5種喹諾酮標樣，分別配制成1 000 μg/mL的標準溶液。每種單標液的上樣體積均為3 mL，連續收集流出液，并分別進行HPLC分析，直至SPE柱吸附達到飽和(流出液與上樣液的濃度相當)。以單標液單點校正法，分別計算各流出液中5種物質的濃度，計算其飽和吸附容量。

1.3.3 HPLC分析 色譜柱：ACE 5 AQ-C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min，15%B;5～8 min，15%～40%B;8～12 min，40%B;12～12.01 min，40%～80%B;12.01～35 min，80%B；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；樣品室溫度：4 ℃。

1.4 蜂蜜中5種喹諾酮類藥物的測定

稱取1 g蜂蜜于50 mL離心管中，加入1 mL不同濃度的喹諾酮混合標液，混合均勻后，再加入10 mL乙腈提取，渦旋3 min，超聲60 min后，高速離心，收集上清液。沉淀物中再加入10 mL乙腈，重復上述操作3次，將所有上清液合并，45 ℃旋蒸至近干，加入1 mL超純水復溶，得到蜂蜜提取液[17]。

將制備的蜂蜜提取液上樣至活化的SPE柱(依次用3 mL甲醇和3 mL超純水活化)。待樣品完全流出后，依次以5%氨化甲醇和甲醇溶液淋洗SPE柱，最后用10%甲酸-甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，氮吹至干，用200 μL 0.1%甲酸水溶液復溶，經濾膜過濾后進HPLC測定。色譜條件除了采用進樣量為20 μL以及梯度程序中0～5 min流動相為17%B外，其余條件同“1.3.3”。

圖2 PP和SAX的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of PP and SAX resins

2 結果與討論

2.1 SAX樹脂的合成及表征

SAX樹脂的合成如圖1所示，與以往方法相比[1,8]，該反應操作簡便、安全，且成本低。所得樹脂(PP，SAX)的紅外光譜如圖2所示，其中PP微粒在1 265 cm-1和710 cm-1處的吸收峰，分別為CH2—Cl上的C—H彎曲振動和C—Cl伸縮振動吸收峰。而SAX微粒在這兩處的吸收峰強度明顯降低，說明C—Cl鍵在修飾反應過程中明顯減少。此外，SAX微粒在891 cm-1處的吸收峰為R—N+—(CH3)3的特征伸縮振動[8]，在1 383 cm-1處的吸收峰為—CH3的彎曲振動峰，說明已成功地將季銨基修飾到樹脂上。

SAX樹脂的掃描電鏡圖如圖3所示。可見樹脂呈大小均勻(粒徑為2～4 μm)、單分散狀態的微球，遠小于商品化Oasis MAX的粒徑(～30 μm)。通過測定，該樹脂的比表面積為6.6 m2/g，孔徑大小為77 ?，粒徑分布在(3.8±1.5) μm之間。通常對于固相萃取填料而言，其粒徑越小，吸附容量越高。此外，采用國標法[18]測定SAX樹脂的離子交換容量為0.83 meq/g，顯著高于Oasis MAX的離子交換容量(0.29 meq/g，測定方法[18])。說明本文所研制的SAX樹脂表面修飾了更多的季銨基團。

2.2 SAX樹脂的吸附選擇性與飽和吸附容量考察

2.2.1 吸附選擇性考察 為了考察本研究合成的SAX樹脂的吸附選擇性，選擇了酸性的尿酸、2種兩性喹諾酮類藥物(洛美沙星和司帕沙星)及堿性的安替比林標準混合溶液(濃度均為10 μg/mL)進行實驗。以1 mL上樣，在本研究所合成的SAX柱和商品化Oasis MAX柱上各步萃取過程中的回收率如表1所示。結果發現，使用SAX柱對弱酸性的尿酸及兩性的洛美沙星、司帕沙星有良好的選擇性吸附，回收率為88.9%～91.3%，相對標準偏差(RSD，n=3)不大于5.5%，且在甲醇淋洗液中未檢測到尿酸、洛美沙星和司帕沙星的色譜峰。這說明該樹脂與弱酸性及兩性化合物之間不僅存在反相作用力，同時存在離子作用力，且離子作用力起主要作用，因此即使采用甲醇作為淋洗液也不能將其淋洗下來。而對于堿性物質安替比林，在5%氨化甲醇淋洗條件下，幾乎全部被淋洗下來，說明其與樹脂間只存在反相作用力。因此，本研究所合成的SAX樹脂具有對堿性物質除雜和對弱酸性及兩性物質選擇性富集的效果。與之相比，Oasis MAX柱對弱酸性的尿酸及兩性的洛美沙星、司帕沙星的吸附回收率為70.1%～86.4%，RSD(n=3)≤13.2%，其吸附選擇性效果不及SAX柱。

表1 4種被測物在SAX和Oasis MAX柱上各步萃取過程中的回收率與相對標準偏差(%，n=3)Table 1 Recoveries and RSDs of four analytes extracted by SAX and Oasis MAX in different steps(%，n=3)

*：RSD values(n=3);-:no peak signal

圖4 SAX和Oasis MAX樹脂對5種喹諾酮類藥物的飽和吸附量Fig.4 Saturated adsorption capacities of five quinolone drugs in SAX and Oasis MAX sorbents

2.2.2 飽和吸附容量測定 按照“1.3.2”方法測得SAX和Oasis MAX柱對5種喹諾酮類物質的飽和吸附容量如圖4所示。結果表明，SAX固相萃取柱對這些物質的飽和吸附容量，均明顯高于商品化Oasis MAX柱，RSD(n=3)≤9.1%。

2.3 SAX固相萃取柱用于蜂蜜中5種喹諾酮類藥物的分析

2.3.1 蜂蜜中喹諾酮藥物的固相萃取-HPLC分析 在優化色譜條件下，未經固相萃取和經SAX固相萃取的蜂蜜加標提取液的色譜圖如圖5所示。由圖可見，在經過固相萃取處理后，不僅可去除大量的基質干擾(如4 min左右基質峰)，而且可選擇性吸附和富集喹諾酮類成分，從而提高了檢測靈敏度和選擇性，有利于對其進行準確定量分析。

圖5 未經固相萃取(A)和經過SAX固相萃取(B)的蜂蜜加標提取液的色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of the spiked honey extracts without(A) or with SAX SPE treatment(B)1.norfloxacin，2.ciprofloxacin，3.lomefloxacin，4.gatifloxacin，5.sparfloxacin；spiked concentrations are 5 μg/g for each compound

2.3.2 方法的線性范圍、檢出限及定量下限 按照“1.4”方法對蜂蜜樣品進行處理，獲得不同濃度(0.010 23～10.71 μg/g)的5種喹諾酮類混合標液，經SAX固相萃取后，進HPLC分析。其中，檢出限和定量下限分別設定為信噪比的3倍和10倍。線性關系、檢出限以及定量下限結果如表2所示。5種喹諾酮類藥物在一定范圍內均呈現良好的線性關系(r2≥ 0.998 9)，其LOD為3～10 ng/g，LOQ為10～34 ng/g。根據我國規定動物食品中喹諾酮類藥物的最高殘留量為0.01～1.9 μg/g[9]，可知該方法的靈敏度較高，可以滿足實際樣品的分析要求。

2.3.3 方法的準確度與重復性 對5種喹諾酮類藥物，分別設定0.2，0.5，1.0 μg/g 3個加標水平，按照“1.4”步驟獲得不同濃度的蜂蜜加標提取液1 mL，上樣至活化的SAX柱。收集3 mL 10%甲酸甲醇洗脫液，氮吹至干，用200 μL 0.1%甲酸水溶液復溶，經濾膜過濾后進行HPLC分析，按照表2中的線性方程，分別計算5種喹諾酮類藥物的濃度和回收率。平行配制6份0.5 μg/g的蜂蜜加標樣品，在同1 d內連續測定，計算5種藥物含量變化的RSD值，即為日內重復性；3天內配制和測定9份0.5 μg/g的蜂蜜加標樣品(每天平行配制和測定3份)，計算3天內5種藥物含量變化的RSD值，即為日間重復性。由表3可見，5種待測物的加標回收率為86.8%～120.3%，RSDs≤7.1%，日內RSDs≤7.0%，日間RSDs≤8.5%，方法的準確度與精密度能夠滿足實際樣品分析的要求。

表2 蜂蜜中5種喹諾酮類藥物的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linearity relations,limits of detection and limits of quantitation of five quinolone drugs in honey samples

LOD:limit of detection,LOQ:limit of quantitation;y:integrated peak area,x:concentration of corresponding standard

表3 蜂蜜中5種喹諾酮類藥物的測定準確度及重復性Table 3 Accuracy and reproducibility of five quinolone drugs in honey samples

3 結 論

本文通過將三甲胺修飾VBC-DVB共聚物，制備了一種SAX樹脂。表征結果顯示，樹脂為呈單分散形態的微球，其粒徑范圍為(3.8±1.5) μm，具有較高的離子交換容量(0.83 meq/g)。該樹脂填料對弱酸性物質(尿酸)及兩性物質(洛美沙星和司帕沙星)的選擇性吸附結果良好(回收率≥ 88.9%)，且對5種喹諾酮類藥物的飽和吸附容量明顯高于同類型商品化Oasis MAX固相萃取柱。將所制備的SAX樹脂用于蜂蜜中5種喹諾酮類藥物的選擇性富集和HPLC分析，方法的靈敏度較高，重現性好，準確度高，可為復雜基質中喹諾酮類藥物殘留的測定提供一種簡單有效的方法。

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Synthesis of a Strong Anion-exchange Resin and Its Application in Enrichment and Determination of Quinolone Drugs in Honey

ZHANG Tian-li,HU Ping,QU Fang-hui,WANG Yue-rong*,ZHANG Hong-yang*

(Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

The chloromethyl styrene-divinylbenzene copolymer(VBC-DVB) was synthesized by the precipitation polymerization.The strong anion-exchange resin(SAX) containing quaternary ammonium group was then functionalized with trimethylamine.The resulting resins were characterized in the form of monodisperse microspheres,with mean diameters of(3.8±1.5) μm.The resin possessed a high ion-exchange capacity(0.83 meq/g) and a good adsorption performance in selectivity,and its saturated adsorption capacities for five quinolone drugs(norfloxacin,ciprofloxacin,lomefloxacin,gatifloxacin,sparfloxacin) were higher than those of conventional commercially available Oasis MAX SPE sorbents.The resin was used for the selective extraction and HPLC analysis of five quinolone drugs in honey samples.The method showed a good linear relationship in the certain concentration with correlation coefficients(r2) not less than 0.998 9.The average spiked recoveries were between 86.8%and 120.3%.The RSDs of intra-day and inter-day were not more than 7.0%and 8.5%,respectively.The results mentioned above indicated that the SAX material prepared was suitable for the efficient pretreatment of quinolone drug residues in complex matrices.

strong anion-exchange；trimethylamine modification；solid-phase extraction；honey；quinolone drugs；HPLC analysis

2016-08-18；

2016-09-20

國家自然科學基金項目(81202493)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.013

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2017)02-0230-06

*通訊作者：章弘揚，博士，副教授，研究方向：復雜樣品前處理與分離分析，Tel：021-64252844，E-mail：hongyang_zhang@ecust.edu.cn 王月榮，博士，講師，研究方向：色譜及其聯用分析，Tel：021-64252844，E-mail：wangyuerong@ecust.edu.cn