氨基酸-磷酸非共價復合物離子的電噴霧電離質譜研究

王奕允，任 娟，李樹奇，孔祥蕾,2*

(1.南開大學 元素有機化學國家重點實驗室，天津 300071;2.天津化學化工協同創新中心，天津 300071)

氨基酸-磷酸非共價復合物離子的電噴霧電離質譜研究

王奕允1，任 娟1，李樹奇1，孔祥蕾1,2*

(1.南開大學 元素有機化學國家重點實驗室，天津 300071;2.天津化學化工協同創新中心，天津 300071)

分子間的非共價相互作用對于理解分子復合物的結構和性質有著非常重要的意義。而電噴霧電離質譜(ESI-MS)是團簇化學研究的一種重要工具，廣泛用于重要生物分子復合物的形成和性質研究，包括氨基酸、多肽和核糖等。該文將一定化學劑量比的磷酸分別與L型精氨酸和L型色氨酸混合，通過電噴霧電離的方法，利用傅立葉變換離子回旋共振質譜儀對精氨酸-磷酸以及色氨酸-磷酸的非共價復合物離子進行了研究。結果顯示，精氨酸和色氨酸均可與磷酸分子產生種類豐富、價態為+1和+2的復合物離子。而對不同體系的生成離子分布進行分析，則顯示出不同體系間的差別。

非共價復合物;電噴霧電離(ESI);精氨酸；色氨酸；磷酸

分子間相互作用是分子識別和組裝的基礎。因此,非共價復合物的檢測、分析和相關研究近年來已成為被廣泛關注的科學問題[1-12]。其中，軟電離方法在一定條件下可使非共價復合物離子在氣相中直接被檢測,從而可得到與化學計量比、結合能等相關的分子復合物信息[1-3]。由于氣相中生成非共價化合物，不受溶劑作用的影響，因此相關體系中的內在氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用可以得到更加清楚的顯示。作為一種非常重要的軟電離方法，電噴霧電離(ESI)是研究分子相互作用的一種重要工具，近年來已被廣泛用于重要生物分子復合物的形成和性質研究[1-12]。ESI在研究生物分子非共價相互作用的過程中，面臨的一個重要問題是如何盡可能使非共價相互作用在離子化的過程中得以保留和最大程度上不被破壞。盡管當前學術界對此問題仍存在爭議[1-2]，但被普遍接受的觀點是：一方面，溶劑的組成、表面張力以及pH 值均會對分子間的相互作用有較大影響；另一方面，電噴霧電離過程中使用的實驗參數(如電場強度、溫度等)也會有所影響。為使實驗中所獲得的復合物離子更接近于其溶液狀態，一般采用兩種相對應的方法：①使電噴霧溶劑的條件盡可能接近于生理條件，以及盡量減少有機溶劑的比例，避免過低或過高的pH值；②盡量采用溫和的ESI實驗條件，如相對較低的加熱溫度，以及避免使用過高的電壓等。

基于氨基酸分子在生物體系中的重要性，氨基酸分子與多種藥物小分子、金屬離子以及氨基酸分子本身之間的相互作用已被廣泛研究[10-18]。如渠琛玲等[10]用電噴霧軟電離技術研究了人參皂苷與多種氨基酸的非共價相互作用,并研究了這些非共價復合物的解離常數。儲艷秋等[11]利用ESI質譜對谷胱甘肽和L型芳香性氨基酸形成的非共價復合物進行了細致的研究。申睿等[12]則利用電噴霧飛行時間質譜研究了氨基化環糊精多種氨基酸所形成的包絡物，通過比較結合常數的大小,探討了氨基化環糊精與氨基酸的作用方式。本課題組也對氨基酸分子本身形成的非共價復合物離子的結構和光譜進行了比較系統的研究[13-17]。

本課題組的前期研究表明，磷酸分子極易與絲氨酸分子形成種類繁多的非共價復合物離子[18]。隨著復合物離子尺寸的變化，它們在碰撞輔助解離過程發生的解離通道也會發生變化。本文分別對精氨酸和色氨酸與磷酸分子在電噴霧電離過程中形成的復合物離子以及離子的分布進行了研究，從而為進一步理解磷酸分子在相關分子復合物的形成以及結構研究提供了基礎。

1 實驗部分

精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)純度為99%，購于Sigma公司；甲醇(J.T.Baker公司)，乙酸(色譜純，天津市光復精細化工研究所)。首先配制20×10-3mol/L的精氨酸/色氨酸溶液與100×10-3mol/L的磷酸溶液，實驗前將其分別稀釋至1 mL的溶劑比為49∶49∶2的H2O∶MeOH∶CH3COOH混合溶液中，最終分別配成濃度為1×10-3mol/L精氨酸/色氨酸與5×10-3mol/L磷酸的混合溶液。

所有的質譜實驗均在7.0T傅立葉變換離子回旋共振(FT ICR)質譜儀上進行(IonSpec,Varian,Lake Forest,CA,USA)。實驗中所有離子均通過電噴霧電離(ESI)離子源產生。其中ESI源噴針的電壓為3.6 kV。為使ESI電離過程比較溫和，實驗中源內加熱溫度設置為60 ℃，低于一般ESI實驗中采用的80 ℃。樣品溶液的流速為240 μL/h。ESI產生的離子經過不同的真空區域后，最終被引入到FT ICR分析池中進行檢測。質譜檢測均采用正離子模式,探測范圍為：m/z200～2 500。

2 結果與討論

2.1 精氨酸-磷酸復合物離子

圖1A顯示了磷酸與精氨酸混合溶液的電噴霧質譜圖。從質譜圖中可以看出混合溶液在電噴霧的過程中產生了多種豐富的復合物離子。其中豐度最高的離子峰來自于精氨酸三聚體Arg3H+(m/z523.333)。而在m/z為600～2 500內產生的大量離子可歸屬為精氨酸-磷酸復合團簇離子，其中豐度較高有[Arg4+(H3PO4)4+H1]1+(m/z1 089.360),[Arg4+(H3PO4)5+H1]1+(m/z1 187.337)和[Arg5+(H3PO4)6+H1]1+(m/z1 459.426)。借助FTICR質譜儀的高分辨和高精度的測量，95%以上的離子峰均可被精確地指認出來，均可表示為[Argm+(H3PO4)n+Hk]k+(簡稱RmPnHkk+)的結構形式。值得注意的是，一價復合物離子RmPnH11+與二價復合物離子R2mP2nH22+的單同位素峰具有相同的質荷比。例如,質荷比為1 187.337的峰，既可以認為是R4P5H11+的同位素峰，也可歸為R8P10H22+的同位素峰。但利用離子的同位素分布和數據擬合可對其進行分析和確認。如圖2所示,通過數據擬合可以確認實驗中觀察到的質荷比為1 187.337的峰實際上為R4P5H11+和R8P10H22+的混合峰，兩者所占的比例分別為82%和18%。

通過對圖1A中的數據進行仔細分析、比對和歸屬，可將所觀察到的離子按照其電荷數進行分類。圖3A和3B分別為其一價和二價復合物離子的分布圖。對于一價復合物離子，根據其精氨酸分子數的不同，將其分為7個系列。整個譜圖中存在R1-7PnH11+的信號，其中R4P1-8H11+,R5P1-9H11+與R6P1-12H11+三個系列具有較高的豐度。在不考慮精氨酸二聚體離子的情況下，這些系列的信號隨著磷酸數目的增加呈現近高斯分布。其中豐度最高的離子峰依次為R4P5H11+,R5P6H11+與R6P7H11+。這表明當磷酸分子數比精氨酸分子數多1時，一價離子更穩定。對于二價復合物離子，譜圖中可以看到7個系列的R8-14PnH22+(圖3B)。其中各系列相應的最高峰依次為：R8P9H22+，R9P10H22+，R10P11H22+，R12P15H22+，R13P16H22+和R14P16H22+。值得注意的是，與之前報道的絲氨酸-磷酸復合物離子相比[18]，體系中產生的三價復合物離子信號非常弱，基本可以忽略。

圖2 實驗中觀察到的m/z為1 187.337離子的峰圖及其同位素分布(A)，離子R4P5H11+的理論計算質譜圖(B)，離子R8P10H22+的理論計算質譜圖(C)，混合離子R4P5H11+(82%)與R8P10H22+(18%)的模擬質譜圖(D)Fig.2 Experimental isotopic distribution of the ions with the isotopic peak at m/z 1 187.337(A),and theoretical isotopic distributions of R4P5H11+(B),R8P10H22+(C) and a mixture of R4P5H11+(82%) and R8P10H22+(18%)(D)

2.2 色氨酸-磷酸復合物離子

圖1B為色氨酸與磷酸混合溶液的電噴霧質譜圖。與精氨酸類似，圖中也顯示出許多色氨酸與磷酸團簇離子的信號。豐度較高的是色氨酸與磷酸產生的團簇離子[Trp3+(H3PO4)12+H1]1+(m/z1 789.073)(簡寫為W3P12H11+),W3P13H11+(m/z1 887.053)等。與精氨酸體系相比，未觀察到三價復合物離子。與精氨酸情況類似，其中一些離子峰是一價復合物離子WmPnH11+與二價復合物離子W2mP2nH22+的混合。例如:質荷比1 495.134的同位素峰，是W3P9Hkk+(73%)和W6P18Hkk+(17%)的混合。為了使整個質譜圖更易讀取，并便于分析和研究，對圖1B中的復合物離子也進行了詳細歸類，其結果顯示在圖4中。圖4A和B分別展示了一價和二價的色氨酸與磷酸形成的復合物離子。根據色氨酸分子數的不同，將一價復合物離子分為3個系列W2-4PnH11+，其中強度最高的離子峰依次為：W2P11H11+,W3P12H11+,W4P9H11+。對于二價復合物離子而言，譜圖中可以看到5個系列的W2-6PnH22+，這些系列的信號隨著磷酸數目的增多呈現近似的高斯分布，相應的最高峰依次為：W3P24H22+,W4P22H22+,W5P21H22+,W6P20H22+和W7P23H22+。

2.3 討 論

圖1的實驗結果顯示，與絲氨酸-磷酸混合溶液的質譜相似[18]，精氨酸和色氨酸與磷酸混合溶液在電噴霧電離的過程中，也能產生豐富的基于氨基酸和磷酸分子的復合物離子。這些離子主要為一價離子和二價離子。這一結果反映了磷酸分子非常容易與多種氨基酸分子形成種類豐富的分子復合物。這主要歸因于磷酸分子在形成氫鍵的過程中，既可以給予質子，又可以成為質子的受體，因此極易與氨基酸分子或它本身形成復雜的氫鍵網絡。

盡管如此，實驗結果也反映了不同體系中存在一定的差別，主要體現在復合物離子的尺寸和組成分布上。對于一價復合物離子，絲氨酸-磷酸復合物離子中豐度較高的離子一般包含磷酸單元的數目約為絲氨酸單元數目的兩倍[18]。而精氨酸-磷酸復合物離子中豐度較高的離子一般包含數目接近的精氨酸單元和磷酸單元。對于色氨酸，其包含的磷酸單元也較多。如對于包含4個氨基酸離子的一價復合物離子，對于絲氨酸、精氨酸和色氨酸，觀察到相應系列中最高豐度的離子分別為S4P9H11+，R4P5H11+和W4P9H11+。對于二價復合物離子，絲氨酸-磷酸復合物中豐度較高的離子一般包含磷酸單元的數目較絲氨酸單元數目多4個，但不及兩倍。而精氨酸-磷酸復合物中豐度較高的離子包含精氨酸單元和磷酸單元仍非常接近。但對于色氨酸，情況更不同，其包含的磷酸單元則遠大于色氨酸單元的數目。另一方面，從總體上看，無論是一價或二價離子，所形成的復合物中包含的色氨酸數目明顯少于絲氨酸和精氨酸。盡管實驗中產生的復合物離子會受實驗條件(如溶液條件、電離源參數)的影響，但考慮到以上實驗均在一臺設備上利用相同(或非常接近)的實驗條件完成，因此結果仍具有較好的可比性。這些區別體現了不同氨基酸分子與磷酸分子相互作用時形成的氫鍵的差別，同時也反映出庫侖相互作用也會對復合物結構產生影響，使得形成的復合物離子也與氨基酸分子本身的結構和極性密切相關。

上述研究結果顯示了磷酸分子易于與精氨酸或色氨酸分子通過氫鍵網絡構建形成種類豐富的分子復合物。盡管這些復合物的具體結構有待于進一步研究，但可以預測的是質子的轉移在復合物的構建、分解和異構化過程中將占有非常重要的作用。而對于不同的氨基酸，其動力學過程也會有較大的區別。同時，當氨基酸分子與多個磷酸分子形成復雜的復合物時，其氨基和羧基端均與磷酸分子形成較強的氫鍵，在一定程度上會對氨基酸分子的活性和反應性有較大的影響。由于磷酸鹽的緩沖液被廣泛應用于生物分子的研究中，這些研究結果也可為相關條件下氨基酸分子的物理化學性質變化提供有價值的線索。

3 結 論

本文通過電噴霧電離的方法在傅立葉變換離子回旋共振質譜儀上得到了精氨酸/色氨酸與磷酸產生的復合物離子。實驗發現，精氨酸/色氨酸與磷酸可以產生豐富的多價態復合物離子RmPnHkk+和WmPnHkk+，通過對不同價態復合物離子的分析，歸納出各自的分布規律。但對這些復合物離子的結構以及隨尺寸變化可能引起的結構變化仍有待于進一步的研究。

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Investigation of Noncovalent Complexions of Amino Acids and Phosphoric Acid by Electrospray Mass Spectrometry

WANG Yi-yun1,REN Juan1,LI Shu-qi1,KONG Xiang-lei1,2*

(1.State Key Laboratory and Institute of Elemento-Organic Chemistry,Nankai University,Tianjin 300071,China;2.Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin),Tianjin 300071,China)

Intermolecular noncovalent interaction is very important for understanding structures and properties of molecular complexes and clusters.Electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS) has demonstrated its powerful utility in the detection and research of weakly bound complex ions,including amino acids,peptides and proteins.In this paper,the noncovalent complex ions of arginine and tryptophan with phosphoric acid were investigated by ESI-MS method.The experiments were performed on a Fourier transform ion cyclotron resonance(FT ICR) mass spectrometer.The results showed that for both systems,wide varieties of noncovalent complex ions were generated and detected in the mass spectra.Most of these complex cations are singly or doubly charged,including both units of amino acid and phosphoric acid.The differences among different systems are also reflected by the distributions of the formed complex ions.

noncovalent complex;electrospray ionization(ESI);arginine;tryptophan;phosphoric acid

2016-10-04；

2016-11-15

國家自然科學基金項目(21475065)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.007

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2017)02-0196-05

*通訊作者：孔祥蕾，博士，副研究員，研究方向：基于質譜和紅光光譜的氣相離子化學,Tel:022-23509564，E-mail:kongxianglei@nankai.edu.cn