微流控芯片-質譜聯用細胞分析方法研究進展

林雪霞，劉 斌，孫向英，林金明

(1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021;2.華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門 361021;3.微量分析測試和儀器研制北京重點實驗室，清華大學 化學系，北京 100084)

微流控芯片-質譜聯用細胞分析方法研究進展

林雪霞1，劉 斌2，孫向英2，林金明3*

(1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021;2.華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門 361021;3.微量分析測試和儀器研制北京重點實驗室，清華大學 化學系，北京 100084)

細胞分析和代謝物分析在生物系統中起著重要的作用。微流控技術已成為細胞生物學研究的一個重要工具。該文總結了最近微流控芯片在細胞和代謝物的分析，尤其是微流控芯片與質譜聯用技術的應用。同時對微流控芯片上細胞的生物學研究提出了見解和看法，希望能對感興趣者提供一些啟發。

微流控芯片；質譜分析；細胞分析；細胞代謝物分析

代謝在生物系統中發揮著重要的作用。它是生命體得以正常運轉的基礎，為生命體提供了多種生物成分(如蛋白質，RNA，DNA和細胞壁)，提供了代謝的中間體，也為生命代謝提供了各種各樣的必需品(如ATP的能量釋放)，并調節和監管了細胞間的信號通路。通過分析細胞代謝物，可以了解生物系統中生理和病理下的反應機制以及細胞間信息的傳遞[1-2]。同時將細胞代謝物的分析與細胞的形態變化、增殖與遷移相結合，將為生命活動規律的探索，藥物的篩選，疾病的診斷與治療提供有力的依據。由于細胞尺寸微小，難以操縱，且細胞內基質復雜。另外，由于與疾病相關的代謝物(如腫瘤標志物)在體內的含量極低，因此對代謝物的研究需要靈敏度更高、選擇性更好的分析方法。

質譜檢測涵蓋了大部分的生物小分子、多肽、蛋白質、酶和核酸等，該方法不僅能夠快速地識別目標分子，一次性檢測出多種化合物，而且能夠進行代謝物的溯源分析，已發展成為生物分析中最重要的檢測手段之一[3-4]。 此外，由于細胞所處體內微環境的變化將引起代謝物種類和含量的變化，甚至引起代謝物的紊亂，而近年快速發展起來的微流控芯片技術可以較好地模擬細胞的生理環境；同時，微型化的通道不會過度稀釋細胞分泌物，是研究細胞間相互作用以及細胞藥物代謝和遞送的理想平臺[5]。本文主要從以下3個方面介紹了微流控芯片，以及微流控芯片-質譜聯用技術在細胞分析和代謝物分析方面的應用和發展：①微流控芯片上細胞微環境的模擬[6]；②微流控芯片-質譜用于細胞的藥物代謝分析[7-8]；③微流控芯片-質譜用于細胞分泌物如蛋白質、生長因子等的分析[9]。

1 微流控芯片上的細胞分析

1.1 微流控芯片上細胞微環境的模擬

微流控芯片(Microfluidic chip)又稱微全分析系統或芯片實驗室(Lab on a chip，LOC)，在20世紀90年代初首次被提出，是指在一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上可以集成或基本集成化學和生物等領域所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元，以微通道形成網絡，貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術平臺[10]。與傳統的培養瓶、培養皿以及孔板用于細胞培養相比，微流控芯片用于細胞培養具有明顯的優勢。芯片設計的自由性為細胞微環境的模擬提供了良好的工具。

圖1 微流控技術用于細胞微環境的模擬[14，16]Fig.1 The application of microfluidic technology for simulation of cell microenvironment[14，16]

細胞在體內并不是單獨存在的，而是與周圍的環境互為一體。細胞的遷移、分化、增殖和凋亡等行為與機體生命活動中的胚胎發育、免疫防御、損傷修復、血管新生以及腫瘤轉移等許多重要生理和病理過程密切相關。而細胞的這些行為在很大程度上受到其所處微環境的調控。胞外基質的理化性質、周圍細胞的生長情況、各種生化因子的濃度及濃度梯度以及細胞所受應力均會對細胞活動產生影響。因此，微流控芯片上細胞微環境需要包含上述生物化學微環境和生物物理微環境。為了模擬體內生化因子的濃度梯度，研究者們在微流控芯片上從最初簡單的T型梯度發生器[11]，發展到樹狀梯度發生器[10]，以及后來衍生出的一系列濃度梯度發生器[12]。研究者通過設計不同的通道長度和利用PDMS的微透氣性獲得了不同含量溶解氧。同時，將兩種不同的細胞共培養在一個芯片，通過對細胞代謝物的分析研究不同氧含量在腫瘤發生、發展中的作用。細胞外基質的模擬，主要以兩種方式進行：一種是將多種細胞進行共培養，來達到模擬體內基質的目的，如魏慧斌等[13]通過對芯片進行設計，將PC12細胞和GH3 細胞進行共培養，通過利用ESI-Mass對多巴胺刺激下的代謝產物進行監測，考察了細胞與細胞間的信號通路以及藥物遞送的情況。介明沙等[14]通過設計多層通道，在芯片上進行了3種細胞的共培養，并通過質譜對藥物代謝的產物進行分析，模擬了藥物在體內的經過肝代謝、腸吸收后作用于腦腫瘤部位(圖1A)。另一種方法是利用各種不同的膠如瓊脂糖、聚乙二醇、海藻酸鈉等材料合成的基質膠來模擬體外基質的軟硬度，如吳靜等[15]利用瓊脂糖，水凝膠模擬細胞體內的基質，將細胞培養在特殊設計的芯片上，很好地實現了細胞的3D培養，構建了體內微血管結構，并實現了量子點對細胞毒性的分析。此外，為了更接近體內的基質，最近研究者常利用各種膠來模擬周邊基質的軟硬度，同時將多種細胞共培養，以此達到不僅維持自身正常的生理活動，而且增加細胞間的相互作用、細胞與微環境間營養物質交換和相互作用等，從而實現體內微環境的模擬。陳秋水等[16]利用海藻酸鈉與鈣離子的交聯合成對溫度、酸度響應的膠，并利用這種合成的膠實現了肝細胞HepG2和纖維細胞NIH-3T3的三維共培養，以模擬小鼠的肝器官(圖1B)。Taubenberger等[17]則通過合成聚乙二醇高聚物水凝膠，采用MALDI-TOF對合成膠的性質進行考察，并利用合成的水凝膠實現了乳腺癌細胞(MCF-7)和人前列腺癌細胞(PC-3，LNCaP)的三維共培養，以及腫瘤血管新生、腫瘤浸潤等過程的研究。

1.2 微流控芯片-質譜用于細胞的藥物代謝分析

圖2 微流控芯片-質譜聯用用于細胞的分析[18]Fig.2 Microfluidic technology with mass spectrometry for cell analysis[18]

隨著分析技術手段的不斷進步以及微流控技術的發展，采用微流控芯片對細胞代謝物的分析應用，已由最初的已知或特定的一種或幾種目標分子的檢測，逐漸發展到對未知物的識別和判斷以及后來的定性定量分析。分析手段也不再僅僅依賴紫外可見光、熒光和電化學檢測技術，質譜、表面增強拉曼以及核磁共振等檢測技術也得到了快速發展。而質譜檢測由于能夠同時進行多種化合物的定性和定量分析，被廣泛地用于細胞代謝物的分析。結合微流控芯片的不斷發展，微流控芯片與質譜技術的聯用使從分子層面上解析細胞的生化信息轉化和調控成為可能。陳秋水等[18]通過在芯片上集成多個功能單元，如培養細胞，藥物刺激，并集成了固相萃取小柱對細胞的藥物代謝產物進行富集，在線洗脫后用ESI-Q-TOF質譜進行檢測，建立了用于藥物篩選的良好的芯片-質譜聯用平臺(圖2)。同時，針對質譜檢測只能半定量的缺點，該作者還發展了同位素內標法，擴大了芯片上質譜檢測的線性范圍，提高了線性指數，真正實現了芯片-質譜聯用對細胞代謝物的定性、定量檢測。

理論上，微流控芯片-質譜技術能夠很好地實現高通量分析，但是高通量的質譜進樣是目前微流控芯片-質譜發展的一個重要難點。為了在質譜上實現多種樣品的自動進樣和分析。林金明課題組[19-21]引進了Inkjet噴墨技術，將微流控芯片與Inkjet噴墨裝置相結合(圖3A)，并將芯片通道上的樣品引入到噴墨設備的多個通道中，然后通過電腦軟件控制噴墨通道的順序和時間實現多個樣品的快速分析。陳鳳明等[19]利用此技術結合毛細管電泳分離技術對細胞和基質進行了初步分離，最后通過ESI-TOF質譜技術對細胞的脂質進行分析(圖3B)。但該裝置需將噴墨設備與芯片通道進行實時連接，容易出現漏液、堵塞等現象。為了改善這種現象，林金明課題組[22]發展了一種間歇式質譜進樣裝置，即在每個通道上分別組裝上一個接觸采樣口，通過控制采樣順序進行樣品的質譜進樣和分析，以用于蛋白質間相互作用的研究(圖4)。此裝置的發展不僅解決了多個通道樣品快速以及順序分析的問題，還可與質譜檢測器實現良好銜接，以用于代謝物的分析。此技術通過將質譜的進樣接口與芯片的通道集成在一個芯片上，相比于噴墨技術，該技術減少了芯片通道與噴墨裝置的連接，從而減少了連接口可能帶來的堵塞、漏液等現象。劉武等[23]利用此技術檢測了不同細胞的乳酸外排，以及在缺氧條件下連續監測藥物α-氰-4-羥基肉桂酸二乙胺鹽對不同的細胞種類乳酸外排的抑制，從而考察了藥物的效用。因此，在芯片-質譜中引入接觸采樣口，不僅可以實現自動化，還可以進行細胞代謝物的檢測以及細胞藥物的篩選。

圖3 Inkjet 噴墨進樣技術與質譜聯用用于細胞在微流控芯片上的分析[19-21]Fig.3 Inkjet technology and mass spectrometry for cell analysis based on microfluidic chip[19-21]

圖4 多通道微流控芯片-質譜聯用用于蛋白質間相互作用的研究[23]Fig.4 Online multi-channel microfluidic chip-mass spectrometry and its application for quantifying non-covalent protein-protein interaction[23]

1.3 微流控芯片-質譜用于細胞分泌物的分析

對細胞代謝物的分析，可以了解生物系統在生理和病理下的反應機制以及細胞間信息的傳遞。同時，將細胞代謝物的分析與細胞的形態變化、增殖與遷移的觀察相結合，將有助于人們探索生命活動規律，從而為疾病的診斷與治療提供有力的依據。由于質譜所具有的高通量、高分辨的優秀性能，因此，常將此技術用于各種已知和未知物的檢測。將高分辨的質譜與微流控芯片的分離功能相結合用于細胞代謝物中細胞因子等分泌物的分析，不僅有利于腫瘤標志物的查找和建立，也有利于對疾病治療進程的監控。 Fortier等[24]在芯片上集成模擬納米液相色譜用于細胞分泌物的分離以及電裂解后，通過質譜對分泌物中的蛋白質進行高分辨檢測。最終實現了將所建立的方法用于鼠血漿樣品中胰島素生長因子的分析以及相關標志物的鑒別。Konry等[25]利用液滴微流控芯片技術實現了單細胞分泌物中白介素10(IL-10)的分析，并監測了 CD4+和CD25+調控下單細胞分泌物中白介素10(IL-10)的分泌。但由于與疾病相關的代謝物含量很少，即使采用高靈敏的質譜，也很難能夠對低豐度的蛋白質、生長因子等分泌物進行分析。因此，靈敏度問題仍然是細胞水平的代謝物分析的難點。何子怡等[26]為了降低分析的檢測限，將質譜技術與寡核苷酸的放大技術聯用。此技術主要通過在抗體尾部結合一段寡核苷酸。當抗體與目標物結合后，尾部的寡核苷酸也被固定在目標物上。此時，再利用滾環擴增技術對連接的寡核苷酸進行拷貝。最后，利用MADLI-Mass對拷貝的寡核苷酸進行檢測，從而實現了細胞表面糖蛋白的高靈敏分析(圖5)。

圖5 寡核苷酸和質譜聯用用于細胞表面蛋白質的分析[26]Fig.5 Assay of cell surface protein based on oligonucleotide and mass spectrometry technologies[26]

2 微流控芯片-質譜用于細胞分析的挑戰

微流控芯片-質譜技術用于細胞和細胞代謝物的分析具有多種顯著的優勢，也有其獨特之處。首先，從微流控芯片方面考慮，在細胞微環境的模擬中，雖然微流控芯片能夠進行一些生理環境的模擬，但是由于對于細胞所處的體內真正的生理環境還不夠清楚，使得模擬的微環境仍需不斷的完善。其次，芯片制作的材料和不同材料的接觸面和比表面積[27]，微量的細胞培養基以及不同條件下細胞的培養，培養基的更換方式等均將影響細胞的生長及代謝[28-30]。傳統的細胞培養裝置材料一般是聚苯乙烯材料。而目前芯片制作的主要材料是PDMS。據報道，細胞在PDMS制備的微流控芯片裝置上培養時，細胞的黏附力和增殖與傳統的培養方法有較大的不同。對于成纖維細胞3T3而言，未處理的PDMS將降低細胞的黏附力，促進細胞死亡[31]。表面積與細胞培養基的體積比值(Surface area-to-volume，SA/V)的改變也將影響細胞的生長[32-34]，如傳統的96孔板的SA/V大約為0.5 mm2/μL，而微流控芯片的SA/V則高達30 mm2/μL[35]。SA/V的急劇變化將極大地影響細胞的行為和生長。如果再次提高此比例，則將影響到細胞的代謝、凋亡等基本功能。此外，與傳統的細胞培養方式相比，微流控芯片上培養的細胞所感受到的氧含量[36-37]、滲透壓[38-39]、pH值[40-41]以及營養消耗的速度[42-43]均可能不同。而這些微流控芯片的設計以及大量參數變化(如培養材料的變化、系統的透氣性等)可能會導致細胞在微流控芯片裝置中的特殊反應[44-45]，從而影響到細胞的各種行為。另外，在芯片上進行細胞的流動培養時，流體的剪切力對細胞和細胞代謝物的影響也需要加以關注[46-48]。

在質譜檢測方面，細胞產生的小分子代謝產物(<500 Da)有可能吸附在PDMS上，從而導致含量的降低，增加了質譜檢測的難度，同時這些吸附的產物還可能會進一步影響到細胞的生長和凋亡、分化等[49-51]。其次，將微流控芯片用于細胞生理環境的模擬，增加了樣品的基質，這也將給質譜分析帶來新的挑戰，對質譜的分辨率和靈敏度提出更高的要求。最后，在芯片-質譜聯用中，由于質譜檢測范圍的限制，常需要對小分子和大分子的代謝物分離后進行檢測，而無法一次完成檢測。因此，需要發展檢測范圍更寬、靈敏度更高的質譜檢測技術用于細胞和細胞代謝物的分析。

3 總結與展望

由于微流控裝置具有設計靈活，易于微型化、自動化等優點，微流控芯片的細胞和代謝物分析已經取得了巨大的進展，為細胞生物學以及細胞生物化學等研究提供了新的思路。而質譜優異的定性功能和多組分分析，使得細胞的分析得到更快速的發展。微流控芯片-質譜聯用在細胞研究中的應用仍然吸引著眾多研究者的關注。我們相信隨著微流控芯片中細胞培養技術的逐漸成熟，用于細胞研究的標準化微流控芯片設計和制備將逐步實現。同時，新的芯片設計將更加簡單有效。其次，為了獲得更加可靠的細胞研究數據，微流控芯片上進行體內微環境的模擬將得到更加快速的發展，各種不同的信號通路將得到更加深入的研究。而能反映細胞或組織在生理或病理下特定響應的細胞代謝物分析，將獲得人們越來越多的關注。因此，雖然將微流控芯片-質譜聯用技術用于細胞的研究仍存在一些挑戰，但其相對于傳統細胞生物學研究的優勢，使其仍將繼續得到更加深入的開發與研究，并被真正地應用于生物醫學、制藥研究、藥物發現和臨床診斷等方面。

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Recent Advances of Microfluidic Technology Coupled with Mass Spectrometry in Cell Analysis

LIN Xue-xia1，LIU Bin2，SUN Xiang-ying2，LIN Jin-ming3﹡

(1.College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China;2.College of Materials Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；3.Department of Chemistry，Beijing Key Laboratory of Microanalytical Methods and Instrumentation，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

Analyses of cell and cell metabolites are important in biological systems.Microfluidic technology is a powerful tool for their studies.In this paper，the recent advances of microfluidic technology,especially its combination with mass spectrometry in cell analysis and cell metabolite's assay，are summarized.Some insights for researchers interested in developing novel，robust microfluidic platforms for cell-biology research，are provided.

microfluidic chip；mass spectrometry；cell analysis；cell metabolite assay

2016-09-21；

2016-10-07

國家自然科學基金資助項目(81373373，21575044，21621003)；福建省自然科學基金(2015J01054，2016J01062)；華僑大學科學資助項目(15BS407)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.005

O657.63

A

1004-4957(2017)02-0184-06

*通訊作者：林金明，教授，研究方向：微流控芯片-質譜聯用細胞代謝物分析，Tel：010-62792343，E-mail：jmlin@mail.tsinghua.edu.cn