纖維素酶輔助粉葛糖化工藝的研究

李妍，林文珍

（肇慶學院化學化工學院，廣東肇慶526061）

纖維素酶輔助粉葛糖化工藝的研究

李妍，林文珍

（肇慶學院化學化工學院，廣東肇慶526061）

在常規糖化工藝基礎上，添加纖維素酶輔助粉葛的糖化。采用單因素試驗、正交試驗優化得到纖維素酶解的最優工藝條件為：纖維素酶用量為0.6%，酶解溫度為55℃，酶解時間為60min，最終糖化液的還原糖含量為8.312 g/100mL，未加纖維素酶處理的糖化液還原糖含量為7.385 g/100mL，說明纖維素酶處理能夠改善粉葛糖化的效果。

粉葛；糖化；纖維素酶；還原糖

粉葛是豆科植物甘葛藤的干燥根，主產于廣東、廣西，四川、云南等地亦產。粉葛口感佳，可藥食兩用，其功效在于解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉[1]。新鮮粉葛中淀粉含量在20%～25%[2]，通過測定烘干至恒重后的廣州食用葛的淀粉含量為（35.46±1.379）%，可溶性糖含量為（16.70%±0.800）%[3]，粗纖維含量在4%～5%[4]。粉葛還含有多種人體必需的氨基酸和鐵、鈣、鋅等微量元素[5]及葛根素等黃酮類物質[6]。以粉葛為原料進行的開發研究主要包括粉葛全粉加工[7]、黃酮含量檢測[8]、不同產地成分對比[9]、重金屬和微量元素檢測[5，10]、貯藏[11]、葛根黃酒[12]、葛根醋飲料[13]研制等。對于粉葛淀粉的研究主要包括淀粉改性[14-15]、酶水解工藝[16]等。黃群等[16]研究了α-淀粉酶和糖化酶協同作用水解葛根淀粉分子，并建立了酶解動力學模型。鐘紅蘭等[17]以超聲為輔助手段，利用中溫α-淀粉酶對葛根粉進行酶解，通過此方法改善了葛根粉的溶解性。

常規的糖化工藝是采用α-淀粉酶和糖化酶進行處理，為了有效利用粉葛中的淀粉和纖維素，本試驗研究應用纖維素酶輔助優化粉葛的糖化工藝，提高粉葛的糖化效率，為進一步開發利用粉葛資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

粉葛：市售，新鮮產品；α-淀粉酶（活力為2000U/g）、糖化酶（活力為10萬U/g，食品級）、纖維素酶（活力為2萬U/g，食品級）：均購自南寧龐博生物工程有限公司；食鹽：市售；檸檬酸（食品級）：購自南京松冠生物科技有限公司；碘、酒石酸鉀鈉（分析純）：上海展云化工有限公司；碘化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅（CuSO4· 5H2O）、次甲基藍、亞鐵氰化鉀：均為分析純，廣州化學試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

XS-10B 500g多功能粉碎機：東莞布隆鑫機電公司；BS210S電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DHG-9070B數顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：蘇州金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

采用相同的液化和糖化工藝，通過加入纖維素酶進行預處理，進而提高糖化效果，對纖維素酶處理的工藝參數進行試驗優化。

1.3.1 粉葛的預處理

粉葛粉制備工藝流程為：粉葛→清洗→去皮→切片→護色→烘干→粉碎→粉葛粉。

將粉葛切成長寬2 cm、厚度0.5 cm的小片狀，并在護色液（食鹽∶檸檬酸∶水=10∶1∶1 000，質量比）浸泡20min～30min[7]，且粉葛片與護色液質量比為1∶3。然后于60℃真空干燥，粉碎備用。

1.3.2 粉葛的糖化

稱取粉葛粉10 g于燒杯中，加入100mL水攪拌均勻，配制成100 g/L的乳液，于85℃～100℃下攪拌糊化。采用α-淀粉酶和糖化酶進行粉葛的糖化，加入粉葛粉質量0.4%的α-淀粉酶，于自然pH進行水解，溫度為70℃，水解時間為60min，液化期間不斷攪拌。然后將液化粉葛漿冷卻至60℃，加酸調pH至4.5，加入粉葛粉質量0.4%的糖化酶，糖化時間為2 h。其后煮沸滅酶，冷卻過濾，量取1.5mL濾液于100mL容量瓶中稀釋至刻度，測定還原糖的含量。

1.3.3 還原糖含量的測定

還原糖含量的測定采用直接滴定法[18]。

1.3.4 纖維素酶用量的單因素試驗

稱取5份粉葛粉，每份10 g，經糊化后調節其pH值為5.0左右，于55℃水浴鍋中，加入纖維素酶的量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均為與粉葛粉質量的比例），恒溫水浴加熱90min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2的操作進行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的纖維素酶用量。

1.3.5 纖維素酶作用時間的單因素試驗

稱取5份粉葛粉，每份10 g，經糊化后調節其pH值為5.0左右，于55℃水浴鍋中，加入0.6%（與粉葛粉量的比例）的纖維素酶，恒溫水浴加熱時間分別為30、50、70、90、110min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2進行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的纖維素酶作用時間。

1.3.6 纖維素酶作用溫度的單因素試驗

稱取4份粉葛粉，每份10 g，經糊化后調節其pH值為5.0左右，分別于35、45、55、65℃水浴鍋中，纖維素酶加入量為0.6%，恒溫水浴加熱50min，期間要不斷攪拌保證酶和樣品充分接觸。然后按照1.3.2進行粉葛的糖化，通過比較樣品濾液的還原糖含量，確定適宜的酶解溫度。

1.3.7 正交試驗優化纖維素酶解工藝

針對纖維素酶作用溫度、酶解時間、酶用量3個影響因素，以樣品濾液的還原糖含量為評價指標，做三因素三水平的正交試驗[19]，按照L9（34）正交表安排實驗，確定纖維素酶解的最優工藝。

1.3.8 空白試驗

準確稱取粉葛粉2份，每份10 g，其中一份不添加纖維素酶，直接按照1.3.2的操作進行糖化，另外一份采用纖維素酶的最優工藝處理后，按照1.3.2的操作進行糖化，分別測定2份樣品濾液的還原糖的含量，進行對比分析。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶用量的確定

纖維素酶用量與樣品濾液還原糖含量的關系見圖1。

圖1 纖維素酶的用量對粉葛糖化的影響Fig.1 The effect of cellulase dosage on kudzu saccharification

由圖1可以看出，當酶用量達到0.6%時，還原糖得率最高，此時的還原糖含量為8.265 g/100mL。原因在于，當纖維素酶濃度達到一定值時，纖維素表面上纖維素酶的吸附達到最大值，反應速度也達到相應的最大值，故繼續增加溶液中酶濃度時，還原糖得率也不再提高[20]。因此，確定適宜的纖維素酶用量為0.6%。

2.2 纖維素酶作用時間的確定

纖維素酶作用時間與樣品濾液還原糖含量的關系見圖2。

由圖2可以看出，反應初始還原糖得率逐漸增加，50min時還原糖得率達到最大值，還原糖含量為8.355 g/100mL，后又有所降低，這主要是在反應初期酶解速度較快，隨著時間的延長，反應液中還原糖的濃度逐漸增加，產生生成物抑制，同時酶活性隨著反應時間的增加逐漸降低。因此，確定適宜的纖維素酶作用時間為50min。

圖2 纖維素酶作用時間對粉葛糖化的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on kudzu saccharification

2.3 纖維素酶作用溫度的確定

纖維素酶作用溫度與樣品濾液還原糖含量的關系見圖3。

圖3 纖維素酶的作用溫度對粉葛糖化的影響Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on kudzu saccharification

一般來說，酶的水解反應存在適宜的溫度范圍，在此范圍內，溫度的提高有利于纖維素酶活性的提高[21]。由圖3可知，纖維素酶處理粉葛的適宜溫度是55℃。

2.4 正交試驗

根據單因素試驗的結果，確定可選擇的因素水平為纖維素酶的酶用量（0.5%、0.6%、0.7%）、酶解時間（40、50、60min）、酶解溫度（50、55、60℃）[10]。因素水平見表1，正交試驗設計及結果分析見表2。

表1 因素水平表Table1 Levels and factors of orthogonal experiment

從表2的極差值（R）可知，影響粉葛糖化的因素主次順序依次為A＞B＞C，其最優方案為A2B2C3，即酶解溫度55℃、纖維素酶量0.6%、酶解時間60min，以此最優方案進行驗證試驗。

表2 正交試驗設計及結果分析Table2 Design and results analysis of orthogonal experiment

2.5 驗證試驗與空白試驗的結果對比

按照纖維素酶解最優方案試驗條件進行糖化，同時做不加纖維素酶的空白糖化試驗，二者樣品濾液的還原糖含量測定結果見表3。

表3 驗證試驗與空白試驗的結果Table3 The results of verification test and blank test

由表3結果可知，驗證試驗結果試樣中還原糖的含量為8.312 g/100mL，空白試驗還原糖的含量為7.385 g/100mL，說明纖維素酶對粉葛糖化有一定的輔助作用。這是因為粉葛中含有一定量的纖維素，在纖維素酶的作用下，水解成葡萄糖等還原糖，而且纖維素的適度水解也有利于后續粉葛淀粉的糖化。將最優方案A2B2C3與正交表中最好的第8號試驗A3B2C3作對比，其試樣中還原糖含量分別為8.312 g/100mL和8.294 g/100mL，顯然最優方案的試驗結果更好，因此，最終確定A2B2C3為真正的最優方案。

3 結論

通過上述試驗結果表明，纖維素酶處理能夠改善粉葛糖化的效果。試驗得到纖維素酶輔助粉葛糖化的最優工藝條件為：纖維素酶用量為0.6%，酶解溫度為55℃，酶解時間為60min，最終糖化液的還原糖含量為8.312 g/100mL，未加纖維素酶處理的糖化液還原糖含量為7.385 g/100mL。

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Study on Saccharification Technology of Kudzu with Cellulase

LI Yan，LIN Wen-zhen
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Zhaoqing University，Zhaoqing526061，Guangdong，China）

On the basis of common saccharification process，the saccharification conditions of kudzu was studied by adding cellulase.Using the single factor tests and orthogonal tests，the optimum saccharification conditions were obtained.The kudzu was hydrolyzed by adding 0.6%cellulase to react at 55℃for 60min.The con tent of reducing sugar of saccharification liquid was 8.312g/100mL，while that of the blank test was7.385g/100mL. The results showed that adding cellulase could improve the effect of kudzu saccharification.

kudzu；saccharification；cellulase；reducing sugar

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.019

2016-06-12

廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃資助項目（Yq2013164）

李妍（1978—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品加工技術與應用。