ER-α36在乳腺癌中激活非基因組信號通路及誘導耐藥

吳水水， 徐雪芬， 黃 劍

雌激素介導的非基因組信號通路的激活，導致的腫瘤耐藥及加速腫瘤干細胞的自我更新等領域一直是乳腺癌研究的熱點。ER，尤其是其變異剪切體ER-α36，在激活乳腺癌非基因組信號通路、誘導耐藥及促進腫瘤干細胞富集等方面的作用，近年來倍受關注[1-5]。

ER主要有ER-α、ER-β以及它們的變異體。ER-α主要包括ER-α66及其剪切體ER-α36和ER-α46[6-7]。ER-α36是一新型的膜性ER，主要通過介導非基因組信號通路來調節乳腺癌細胞的功能[8-9]。該文將著重就ER-α36的結構、介導的非基因組信號通路、內分泌治療耐藥及乳腺癌干細胞的關系進行綜述。

1 ER-α36的結構

2005年Dr.Wang的實驗室發現一種新型的ER，為ER-α66的剪切變異體，該剪切變異體缺乏ER-α66的轉錄激活區，保留DNA結合結構域及部分二聚體和配體結合結構域，相對分子質量為3.6×104，因此命名為ER-α36[8]。ER-α66主要定位于細胞核，而ER-α36主要位于細胞膜和細胞質，又稱為膜性ER。ER-α36是從ER-α66基因的第1個內含子中的啟動子開始編碼的，與ER-α66的結構比較，缺乏AF-1和AF-2轉錄激活區，保留了DNA結合結構域、部分二聚體和配體結合結構域。ER-α36的C末端有27個額外的獨特氨基酸序列，以取代ER-α66外顯子7和8編碼的C末端138個氨基酸。ER-α36還具有3個潛在的酰基化位點，故ER-α36蛋白主要定位于細胞膜(50%)，部分定位于細胞質(40%)，少數定位于細胞核(10%)[8,10]。ER-α66的另一剪切體ER-α46，相對分子質量為4.6×104，在ER-α46的結構中，選擇性剪切了第1個編碼外顯子，所以缺乏ER-α66 N端的173個氨基酸，即A/B區或AF-1區，其它結構和ER-α66相同[8]。ER-α46在乳腺癌中的作用，尚不清楚。

2 ER-α36介導的非基因組信號通路

新型ER-α36可介導由乳腺癌細胞膜始發的雌激素信號，激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)等胞內信號通路-即非基因組信號通路，調節乳腺癌細胞的生長增殖。研究發現,ER-α36能抑制ER-α66和ER-β的E2依賴和E2非依賴轉錄活性，并參與其誘導的MAPK/ERK和PI3K/AKT快速磷酸化[9]。在E2作用下，在ER-α66+/ER-α36+乳腺癌細胞系MCF7、T47D和H3396中，胞內MAPK/ERK信號通路被快速激活；當用shRNA特異性沉默ER-α36后，E2不能誘導MAPK/AKT磷酸化。而當特異性沉默ER-α66后，在ER-α36存在的狀態下，E2仍然能誘導MAPK/AKT磷酸化。該研究清楚表明，MAPK/AKT的磷酸化，不是由ER-α66而是由ER-α36的快速雌激素信號介導[11-12]。另有研究顯示，ER-α36能誘導胞內信號通路RAS/MAPK/ERK和PI3K/AKT活化，并誘導原癌基因c-myc的編碼產物c-myc表達，促進腫瘤細胞的生長與增殖[13]。新近一項實驗發現，ER-α36通過激活E2介導的MAPK/ERK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和遷移[4]。除乳腺癌外，ER-α36在其它腫瘤亦能激活非基因組信號通路。在子宮內膜癌Ishikawa細胞中，E2通過ER-α36快速激活PKCδ/ERK通路，增強Cyclin D1/CDK4表達[14]。上述研究結果均表明新型雌激素膜受體ER-α36，介導E2誘導的胞內信號通路，促進MAPK/ERK和PI3K/AKT快速磷酸化，影響腫瘤細胞生長增殖等生物學特性。

EGFR和HER-2是HER上皮生長因子受體家族(包括HER-1即EGFR、HER-2、HER-3和HER-4)中最重要的成員[15]。乳腺癌中EGFR基因擴增和蛋白過表達現象已有明確報道[16]。HER-2基因擴增和蛋白過表達是乳腺癌惡性特征的重要表現[17]，而20%～30%乳腺癌呈HER-2陽性。研究發現，ER-α36和EGFR/HER-2存在分子間的雙向交互作用，ER-α36正向調節EGFR和HER-2表達，EGFR亦可通過ER-α36基因的5’編碼區AP1結合位點誘導ER-α36表達，且ER-α36可穩定EGFR蛋白表達，促進E2誘導的HER-2表達[18-19]。ER-α36亦可和EGFR/Src/Shc復合體相互作用，活化Src和EGFR，進而激活胞內MAPK/ERK和EGFR/STAT5信號通路，從而促進乳腺癌細胞生長增殖[18]。低濃度E2誘導ER-α36通過Src-Y416磷酸化，激活Src，進而激活EGFR/STAT5信號通路，促進乳腺癌細胞增殖[20]。在ER-α66-/ER-α36+/HER-2+的乳腺癌SKBR-3細胞中，特異性沉默ER-α36后，降低HER-2蛋白的表達，表明ER-α36和HER-2之間存在密切的關系[19]。上述實驗結果均表明，ER-α36可能通過和EGFR/HER-2生長因子受體家族的雙向交互作用，激活非基因組信號通路。

3 ER-α36與Tamoxifen耐藥

Tamoxifen是選擇性ER調節劑，廣泛用于治療進展期ER陽性乳腺癌，已成為絕經前和絕經后乳腺癌高危患者的預防藥物。但30%～40%的乳腺癌患者在Tamoxifen治療后出現繼發耐藥。主要的耐藥機制有ER表達缺失或突變、藥物代謝基因突變、多種生長因子轉導的通路，如PI3K/AKT、AMPK/ERK通路異常激活等[21]。ER-α36在ER陽性乳腺癌Tamoxifen耐藥方面的作用，近年來也倍受關注。ER-α66+/ER-α36+的乳腺癌患者，與ER-α66+/ER-α36-的乳腺癌患者相比，無瘤生存率和疾病特殊生存率DSS均較低，且不易從Tamoxifen治療中獲益[22]。一項對Tamoxifen耐藥的乳腺癌細胞研究顯示，Tamoxifen誘導ER-α66+乳腺癌MCF-7細胞過表達ER-α36，繼而腫瘤細胞對Tamoxifen產生耐藥。當沉默ER-α36后，乳腺癌細胞可恢復對Tamoxifen治療的敏感性[23]。可見，Tamoxifen可能通過ER-α36的介導，激活胞內信號通路RAS/MAPK/ERK和PI3K/AKT。MAPK/ERK信號通路的持續激活，在細胞生長和增殖中發揮重要作用，而PI3K/AKT信號通路的持續激活，促使乳腺癌細胞逃逸Tamoxifen誘導的凋亡[3]，ER-α36過表達或許是Tamoxifen耐藥的機制之一[7]。

在乳腺癌Tamoxifen治療獲得性耐藥的發展過程中，乳腺癌細胞從開始的雌激素依賴性生長，轉變為生長因子依賴性生長。在乳腺癌MCF-7/TAM耐藥細胞中，ER-α36和EGFR表達升高，細胞生長速度加快，體外遷移和侵襲能力增強。當特異性沉默ER-α36后，引起EGFR蛋白表達降低，從而導致細胞生長增殖、體外遷移和侵襲能力均減弱[24]。另一研究亦表明，ER-α36與EGFR/HER-2相互作用，影響乳腺癌細胞生長增殖，促進Tamoxifen耐藥；用雙重絡氨酸激酶抑制劑Lapatinib或ER-α36下調劑Broussoflavonol B，阻斷ER-α36與EGFR/HER-2正向調節回路，能恢復MCF-7/TAM細胞對Tamoxifen處理的敏感性[25]。綜上所述，ER-α36和EGFR/HER-2相互作用，可能是乳腺癌細胞Tamoxifen耐藥的主要機制[26]。

4 ER-α36與乳腺癌干細胞

越來越多的證據支持腫瘤干細胞學說，該學說認為腫瘤起源于具有干細胞特性的細胞亞群，具有細胞自我更新、腫瘤形成和多潛能分化的能力，腫瘤干細胞在乳腺癌發生、發展和轉移中的重要作用，日益受到關注。在SKBR-3(ER-α66-/ER-α36+)乳腺癌細胞中，ALDH1+干細胞亞群和高度表達ER-α36的亞群為同一細胞群體。當特異性沉默ER-α36后，ALDH1+腫瘤干細胞數量顯著減少，表明ER-α36和乳腺癌干細胞亞群關系密切[19]。在MCF7和T47D乳腺癌細胞中，富集了CD44+CD24-腫瘤干細胞亞群，亦過度表達ER-α36，且通過ER-α36激活胞內信號通路PI3K/AKT，促進腫瘤細胞增殖及誘導Tamoxifen和ICI182,780耐藥[12]。ER-α36可能在乳腺癌干細胞及耐藥亞群中發揮重要作用。

5 展望

目前，乳腺癌主要的治療方式包括手術治療、放療及靶向治療。靶向治療毒副作用輕、有廣泛的前景，如抗ER的Tamoxifen治療。然而，Tamoxifen治療過程中產生的耐藥，是乳腺癌靶向治療過程中最大的挑戰。ER-α36膜受體可能通過和生長因子受體EGFR/HER-2分子間的雙向交互作用，激活胞內AMPK/ERK、PI3K/AKT信號通路，最終導致乳腺癌細胞生長增殖及Tamoxifen耐藥。因此，抗ER-α36可能成為抵御Tamoxifen耐藥的重要手段，并將可能成為今后乳腺癌治療的特異性新靶點。

[1] Wang Z Y, Yin L. Estrogen receptor alpha-36 (ER-alpha36): a new player in human breast cancer[J]. Mol Cell Endocrinol, 2015,418(3):193-206.

[2] Su X, Xu X, Li G,etal. ER-alpha36: a novel biomarker and potential therapeutic target in breast cancer[J]. Oncol Targets Ther, 2014,7:1525-1533.

[3] Teymourzadeh A, Mansouri S, Farahmand L,etal. ER-alpha36 interactions with cytosolic molecular network in acquired tamoxifen resistance[J]. Clin Breast Cancer, 2017,17(16):403-407.

[4] Sun Q, Liang Y, Zhang T,etal. ER-alpha36 mediates estrogen-stimulated MAPK/ERK activation and regulates migration, invasion, proliferation in cervical cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,487(3):625-632.

[5] Gu W, Dong N, Wang P,etal. Tamoxifen resistance and metastasis of human breast cancer cells were mediated by the membrane-associated estrogen receptor ER-alpha36 signalinginvitro[J]. Cell Biol Toxicol, 2017,33(2):183-195.

[6] Kong E H, Pike A C, Hubbard R E. Structure and mechanism of the oestrogen receptor[J]. Biochem Soc Trans, 2003,31(1):56-59.

[7] Encarnacion C A, Fuqua S A. Estrogen receptor variants in breast cancer[J]. Cancer Treat Res, 1994,71:97-109.

[8] Wang Z, Zhang X, Shen P,etal. Identification, cloning, and expression of human estrogen receptor-alpha36, a novel variant of human estrogen receptor-alpha66[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,336(4):1023-1027.

[9] Wang Z, Zhang X, Shen P,etal. A variant of estrogen receptor-{alpha}, hER-{alpha}36: transduction of estrogen- and antiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(24):9063-9068.

[10] Rao J, Jiang X, Wang Y,etal. Advances in the understanding of the structure and function of ER-alpha36, a novel variant of human estrogen receptor-alpha[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2011,127(3-5):231-237.

[11] Zhang X, Deng H, Wang Z Y. Estrogen activation of the mitogen-activated protein kinase is mediated by ER-alpha36 in ER-positive breast cancer cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014,143(6):434-443.

[12] Deng H, Yin L, Zhang X T,etal. ER-alpha variant ER-alpha36 mediates antiestrogen resistance in ER-positive breast cancer stem/progenitor cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014,144(Pt B):417-426.

[13] Lin S L, Yan L Y, Zhang X T,etal. ER-alpha36, a variant of ER-alpha, promotes tamoxifen agonist action in endometrial cancer cells via the MAPK/ERK and PI3K/Akt pathways[J]. PLoS One, 2010,5(2):9013-9021.

[14] Tong J S, Zhang Q H, Wang Z B,etal. ER-alpha36, a novel variant of ER-alpha, mediates estrogen-stimulated proliferation of endometrial carcinoma cells via the PKCdelta/ERK pathway[J]. PLoS One, 2010,5(11):15408-15418.

[15] Yarden Y, Sliwkowski M X. Untangling the ErbB signalling network[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001,2(2):127-137.

[16] Kumar R, Wang R A. Protein kinases in mammary gland development and cancer[J]. Microsc Res Tech, 2002,59(11):49-57.

[17] Arteaga C L, Engelman J A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics[J]. Cancer Cell, 2014,25(3):282-303.

[18] Zhang X T, Kang L G, Ding L,etal. A positive feedback loop of ER-alpha36/EGFR promotes malignant growth of ER-negative breast cancer cells[J]. Oncogene, 2011,30(7):770-780.

[19] Kang L, Guo Y, Zhang X,etal. A positive cross-regulation of HER2 and ER-alpha36 controls ALDH1 positive breast cancer cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2011,127(3-5):262-268.

[20] Zhang X T, Ding L, Kang L G,etal. Involvement of ER-alpha36, Src, EGFR and STAT5 in the biphasic estrogen signaling of ER-negative breast cancer cells[J]. Oncol Rep, 2012,27(6):2057-2065.

[21] Rondon-Lagos M, Villegas V E, Rangel N,etal. Tamoxifen Resistance: Emerging Molecular Targets[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(8):1357-1387.

[22] Shi L, Dong B, Li Z,etal. Expression of ER-alpha36, a novel variant of estrogen receptor alpha, and resistance to tamoxifen treatment in breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2009,27(21):3423-3429.

[23] Zhang X, Wang Z Y. Estrogen receptor-alpha variant, ER-alpha36, is involved in tamoxifen resistance and estrogen hypersensitivity[J]. Endocrinology, 2013,154(6):1990-1998.

[24] Li G, Zhang J, Jin K,etal. Estrogen receptor-alpha36 is involved in development of acquired tamoxifen resistance via regulating the growth status switch in breast cancer cells[J]. Mol Oncol, 2013,7(3):611-624.

[25] Yin L, Pan X, Zhang X T,etal. Downregulation of ER-alpha36 expression sensitizes HER2 overexpressing breast cancer cells to tamoxifen[J]. Am J Cancer Res, 2015,5(2):530-544.

[26] Yin L, Wang Z Y. Roles of the ER-alpha36-EGFR/HER2 positive regulatory loops in tamoxifen resistance[J]. Steroids, 2016,111:95-99.