TTP對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1凋亡的調(diào)控

朱光奎，賀文輝，鄭 穎，劉家駒，程子利，錢(qián)雪松

(1.河北省灤平縣醫(yī)院內(nèi)科，河北 灤平 068250；2.河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

TTP對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1凋亡的調(diào)控

朱光奎1，賀文輝1，鄭 穎2，劉家駒1，程子利1，錢(qián)雪松3*

(1.河北省灤平縣醫(yī)院內(nèi)科，河北 灤平 068250；2.河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的觀察TTP (trisetetraprolin) 對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1凋亡的影響。方法構(gòu)建mTTP真核表達(dá)質(zhì)粒PCR3.1/mTTP；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆；用終濃度0.1 μmol的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素處理6 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果經(jīng)G418篩選，成功得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mTTP的細(xì)胞株P(guān)CR3.1+mTTP和PCR3.1(陰性對(duì)照)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mTTP的表達(dá)，4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCR3.1/mTTP之后，mTTP的表達(dá)明顯增高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP 3種細(xì)胞的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑作用后PCR3.1+mTTP細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡率為29.5%，而4T1、4T1+PCR3.1細(xì)胞的凋亡率分別為17.0%和18.0%。結(jié)論成功構(gòu)建了TTP高表達(dá)的小鼠乳腺癌細(xì)胞系PCR3.1+mTTP，該細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)藥物星形孢菌素的敏感性增加。

乳腺腫瘤；細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)染

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年新增乳腺癌患者人數(shù)約占腫瘤患者的23%[1]。外科手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌等治療是目前乳腺癌治療的幾種常規(guī)手段，但是由于乳腺癌的異質(zhì)性，使得治療并非對(duì)于所有乳腺癌均有效，腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐藥作為目前尚難克服的問(wèn)題，仍困擾臨床。Tristetraprolin (TTP，又被稱(chēng)ZFP36、TIS11、NUP475和G0S24) 是一種表達(dá)在很多組織細(xì)胞膜上的鋅指體蛋白[2]，具有轉(zhuǎn)錄因子活性。TTP首先被發(fā)現(xiàn)可以與腫瘤壞死因子α的mRNA的AUrich elements(ARE)區(qū)相結(jié)合從而促進(jìn)腫瘤壞死因子α的降解。此外，mTTP還可以調(diào)控很多其他的目的基因。本研究擬通過(guò)在乳腺癌細(xì)胞系4T1中過(guò)表達(dá)TTP，探討其對(duì)該細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1、真核表達(dá)質(zhì)粒PCR3.1均為河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室保存。星形孢菌素(Staurosporine)購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；G418為Sigma公司產(chǎn)品Lipofectamine 2000，購(gòu)自Invitrogen公司；Annexin-V-Biotin凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Biovision公司產(chǎn)品；SYBR-Premix Ex TaqTM、TrizolTM Reagent核酸分離試劑，均為日本Takara公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP及RNA酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。引物合成由上海生物技術(shù)公司完成。

1.2 4T1細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存在液氮罐中的細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸起，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶面積的 85%左右時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞4T1以密度(0.5～2)×105/孔置于24孔板，500 μL/孔，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000分別將空白質(zhì)粒(PCR3.1)或攜帶mTTP的表達(dá)質(zhì)粒PCR3.1/mTTP分別轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參考Invitrogen公司說(shuō)明書(shū)。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮的含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18～48 h。然后用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆篩選 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入終濃度為500 mg/L 的G418，隔日更換新鮮的含有G418的完全培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡下觀察到空白對(duì)照組細(xì)胞(即未經(jīng)轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞)全部死亡后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4T1 PCR3.1或4T1 PCR3.1+mTTP的細(xì)胞系。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mTTP的表達(dá) G418藥篩細(xì)胞4周后，將4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞分別以1×106/孔的密度鋪于6孔板中。培養(yǎng)過(guò)夜后棄掉舊培養(yǎng)液，換用新鮮含RPMI-1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞的mTTP的表達(dá)。PCR擴(kuò)增置于的引物為β-actin Forward Primer:5′-GCTACAGCTTCACCACCA-CAG-3′；β-actin Reverse Primer:5′-GGTCTTTAC-GGATGTCAACGTC-3′；mTTP Forward Primer:5′-AATCCCTCGGAGG-ACTTTGGAACA-3′；mTTP Reverse Primer:5′-AGTTGCAGTAGGCGAAGT-AGGTGA-3′。

1.6 星形孢菌素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 將4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞分別以1×106/孔的密度鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為(0.1 μmol)的星形孢菌素，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 取一次性Falcon試管按順序依次做好標(biāo)記。分別取培養(yǎng)狀態(tài)良好的經(jīng)星形孢菌素處理或未經(jīng)處理的4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞，加入到做好標(biāo)記的Falcon管，用1 mL預(yù)冷的PBS洗滌2次。 加1×Binding buffer 把細(xì)胞調(diào)成1×106cell/mL的單個(gè)細(xì)胞懸液。每管再分別都加入5 μL碘化丙啶和5 μL Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白輕輕混勻，室溫20 ℃，避光放置15 min。將待檢樣本3個(gè)Falcon試管在流式細(xì)胞檢測(cè)儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，并保留數(shù)據(jù)圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的mTTP表達(dá) 將構(gòu)建好的帶目的基因的質(zhì)粒PCR3.1/mTTP，以及作為對(duì)照的質(zhì)粒PCR3.1，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞系，培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞，提取總RNA，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mTTP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示4T1 PCR3.1+mTTP組mTTP的表達(dá)明顯高于4T1組和4T1 PCR3.1組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的mTTP表達(dá) 選擇最適濃度(500 mg/L)的G418來(lái)篩選細(xì)胞，4周后建立穩(wěn)定表達(dá)mTTP的4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞系和陰性對(duì)照4T1 PCR3.1細(xì)胞系。首先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：PCR3.1+mTTP和PCR3.1細(xì)胞形態(tài)與野生型細(xì)胞保持一致，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1)。收集細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示3種細(xì)胞mTTP的表達(dá)有明顯區(qū)別，即PCR3.1+mTTP組的mTTR表達(dá)量明顯高過(guò)于其余2個(gè)細(xì)胞組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后PCR3.1+mTTP細(xì)胞中的mTTP表達(dá)Table 1 Expression of mTTP in PCR3.1+mTTP cells after stable transfection and stable transfection

*P<0.05與4T1組比較 #P<0.05與4T1 PCR3.1組比較(q檢驗(yàn))

圖1 PCR3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不會(huì)導(dǎo)致PCR3.1+mTTP細(xì)胞形態(tài)的改變( ×100)

2.3 細(xì)胞的凋亡情況 4T1和4T1 PCR3.1細(xì)胞與4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞的雙陽(yáng)百分比數(shù)值分別為4.2%、4.7%、4.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.850，P>0.05)，說(shuō)明mTTP對(duì)PCR3.1+mTTP細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。當(dāng)在3種細(xì)胞中都加入促進(jìn)凋亡的藥物星形孢菌素，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)6 h，再以流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)得的3組細(xì)胞的雙陽(yáng)值，依次為29.5%、18.0%、17.0%，顯然4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞中的目的基因mTTP，提高了4T1 PCR3.1+mTTP細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素的敏感性。

3 討 論

TTP調(diào)節(jié)mRNA最有力證據(jù)是在TTP基因敲除小鼠的動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)的，在這種TTP基因敲除小鼠的巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α的mRNA表達(dá)非常穩(wěn)定，也就是說(shuō)一般的細(xì)胞因子在產(chǎn)生后都有一定的半衰期，但是TTP的作用可以增加腫瘤壞死因子mRNA的穩(wěn)定性，降低衰變的程度，使循環(huán)中的腫瘤壞死因子α的濃度非常高，導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥綜合征。基因敲除小鼠的主要表現(xiàn)為小鼠骨髓、髓外髓系增生和惡病質(zhì)，侵蝕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎，皮炎，腎小球系膜增厚，高滴度的抗DNA和抗核抗體[3-4]。后來(lái)又發(fā)現(xiàn)TTP可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10，白細(xì)胞介素23等，這些因子大多與炎癥相關(guān)聯(lián)。眾所周知，炎癥與腫瘤有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，慢性感染和炎癥是腫瘤發(fā)生的重要誘因，TTP對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)可以直接或間接影響到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TTP在一些腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)過(guò)低。本研究旨在了解TTP在乳腺癌細(xì)胞系4T1中過(guò)表達(dá)后，對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。本研究成功地制備了過(guò)表達(dá)TTP的乳腺癌細(xì)胞系PCR3.1+mTTP，TTP在沒(méi)有促凋亡因素存在的情況下并不會(huì)提高細(xì)胞的凋亡率，但是在加入促凋亡藥物后可以提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，故TTP可以提高癌細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)藥物的敏感性。

腫瘤細(xì)胞通常是通過(guò)破壞一個(gè)主要的通路完成細(xì)胞的非正常生長(zhǎng)和惡變的。TTP作為一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子，可通過(guò)與其他分子的ARE區(qū)結(jié)合參與腫瘤細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)，影響腫瘤的發(fā)展。有研究者報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中表達(dá)TTP可以降低白細(xì)胞介素3的水平[5-6]，而白細(xì)胞介素3在腫瘤中異常高表達(dá)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的增殖是通過(guò)白細(xì)胞介素3的自分泌途徑實(shí)現(xiàn)的，所以通過(guò)TTP抑制白細(xì)胞介素3的合成就可以減緩腫瘤的生長(zhǎng)，并且在腫瘤接種的活體模型中可以顯著地減緩腫瘤的形成。因此，TTP被稱(chēng)為腫瘤抑制器[7-8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌TTP的表達(dá)和腫瘤的進(jìn)展呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)，乳腺癌患者低表達(dá)TTP比高表達(dá)預(yù)后要差；TTP的基因多態(tài)性與乳腺癌患者對(duì)曲妥單抗的反應(yīng)性下降有關(guān)[9]。

細(xì)胞的死亡通常有2種形式：一種是病理性死亡，稱(chēng)為壞死(necrosis)，是由于局部缺血、高熱、理化因素及微生物侵襲導(dǎo)致的細(xì)胞急速死亡，細(xì)胞發(fā)生壞死重要的特點(diǎn)是細(xì)胞腫脹、溶解，釋放出裂解產(chǎn)物，使周?chē)M織發(fā)生炎癥反應(yīng)；另外一種是生理性死亡——凋亡，又稱(chēng)程序性死亡。在凋亡發(fā)生的早期，細(xì)胞核固縮、邊緣化，胞漿發(fā)生濃縮，凋亡晚期細(xì)胞核片段化，被膜包裹、隆起并且產(chǎn)生凋亡小體，最后被巨噬細(xì)胞吞噬，在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。與細(xì)胞壞死相比，凋亡不造成周?chē)M織的炎癥反應(yīng)。腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。未經(jīng)治療的惡性腫瘤有細(xì)胞凋亡發(fā)生[10]。1972年Kerr等在提出凋亡概念的同時(shí)預(yù)測(cè)：惡性腫瘤中的自發(fā)凋亡可能會(huì)涉及到導(dǎo)致腫瘤消退的治療作用。腫瘤自發(fā)凋亡的常見(jiàn)原因有以下幾個(gè)：①缺血、缺氧所激發(fā)的凋亡，腫瘤組織內(nèi)部接近融合灶的部位容易發(fā)生供血和供氧的不足；②存在于腫瘤組織內(nèi)部的巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α，腫瘤壞死因子α結(jié)合腫瘤壞死因子受體1激活caspase-3途徑引起凋亡；③ 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞攻擊載有靶抗原的腫瘤細(xì)胞引起凋亡，這種凋亡是經(jīng)顆粒酶β(granzyme β)激活caspases途徑而發(fā)生的。腫瘤細(xì)胞中的自發(fā)凋亡是機(jī)體抗腫瘤的一種保護(hù)機(jī)制，是細(xì)胞受損后機(jī)體將有害細(xì)胞清除的生理途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，TTP在乳腺癌細(xì)胞系4T1的高表達(dá)雖然不能直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的增加，但是在使用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物后明顯提高了腫瘤細(xì)胞的凋亡率[11-12]。

綜上所述，TTP在乳腺癌細(xì)胞系4T1的高表達(dá)雖然不能直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的增加，但可以增加對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物的敏感性。

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(本文編輯：劉斯靜)

The apoptosis regulation on mice breast cancer cell line 4T1 by TTP

ZHU Guang-kui1, HE Wen-hui1,ZHENG Ying2， LIU Jia-ju1, CHENG Zi-li1, QIAN Xue-song3*

(1.DepartmentofInternalMedicine，theHospitalofLuanpingCounty,HebeiProvince，Luanping068250,China；2.TheExperimentCenter,ClinicalCollegeofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China；3.DepartmentofImmunology,theSchoolofBasicMedicalSciences,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To establish a mouse breast cancer cell line 4T1 with high TTP (trisetetraprolin) expression and to observe the effect of TTP on breast cancer cell line 4T1 apoptosis. Methods The breast cancer 4T1 cell line was stably transfected with the plasmids of PCR3.1 and PCR3.1/mTTP by Lipofectamine 2000. The cell apoptosis was detected using flow cytometry technology. Results Higher mTTP expression was detected in 4T1 cells that has been transfected with PCR3.1+mTTP plasmid using real time quantitative PCR. The apoptosis rate among 4T1, 4T1 PCR3.1 and 4T1 PCR3.1+mTTP was not significant difference. But after treatment the cells with Staurosporine, a apoptosis promoting medicine, for 6 hours, apoptosis rate of 4T1 PCR3.1+mTTP cell line was increased. The apoptosis rate of 4T1, 4T1 PCR3.1 and 4T1 PCR3.1+mTTP was 17%, 18% and 29.5%, respectively. Conclusion mTTP could not enhance 4T1 cell apoptosis directly, but it could increase the sensitivity of 4T1 to apoptosis inducing medicine.

breast neoplasms； apoptosis； transfection

2016-09-24；

2016-10-30

教育部留學(xué)人員科研啟動(dòng)資金；河北省留學(xué)人員科技活動(dòng)資助項(xiàng)目(2014003031)

朱光奎(1977-)，男，河北承德人，河北省灤平縣醫(yī)

院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事內(nèi)科疾病診治研究。

R737.9

A

1007-3205(2017)02-0129-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.002

*通訊作者。 E-mail：13363856305@163.com