MTT法檢測異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用

夏春輝，王玉，陳宇航，孫東升，付雙，李紅梅

齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾161006

MTT法檢測異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用

夏春輝，王玉，陳宇航，孫東升，付雙，李紅梅

齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾161006

目的研究異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑藍染色法(MTT法)測定異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用。結果異咯嗪光動力能明顯抑制Bel-7402細胞。結論異咯嗪是一種很有潛力抗癌光敏劑。

異咯嗪；光動力；凋亡；Bel-7402細胞

腫瘤光動力治療(photodynamic therapy)是一種新型的治療腫瘤技術。該技術是基于特定波長的光激發腫瘤細胞攝入的光敏劑，生成活性很強的活性氧，從而殺死腫瘤細胞[1-3]。光敏劑是光動力治療的關鍵。由于異咯嗪毒副作用小，表現出較強的光敏特性，因而它可能是很有前途的抗腫瘤光敏劑[4-6]。該文采用四甲基偶氮唑藍染色法(MTT染色法)研究了異咯嗪（結構見圖1）光動力對Bel-7402細胞的抑制作用，以期為其臨床應用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 材料

異咯嗪與MTT為Sigma公司產品；DMEM培養基Gibco公司產品；牛血清為PAA公司產品；其他試劑為國產分析純；Bel-7402人肝癌細胞為哈爾濱醫科大學腫瘤研究所提供。

1.2 儀器及設備

VS-1300L-U凈化工作臺；3111二氧化碳培養箱；SB-100P黑光燈；DSZ－5000X倒置生物顯微鏡，680全自動酶標儀。

1.3 細胞培養

在37℃，含5%CO2的培養箱內，Bel-7402人肝癌細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基（鏈霉素與青霉素的終濃度為100 mg/L）培養。

1.4 MTT染色法測定異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用

取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后，調整濃度約為4×104個/mL，然后接種于96孔培養板中。在培養孔中加入濃度為4 μg/mL的異咯嗪新培養液，用SB-100P燈照射60 min。在37℃下加入PBS配制的MTT溶液（5 g/L），培養4 h，在倒置顯微鏡下觀察經異咯嗪光動力作用后的細胞。吸取上清，加入200 μL DMSO，在波長570 nm處測定吸光度值A。然后根據公式：細胞抑制率=(1－A實驗孔/A空白對照孔)×100%進行計算。

圖1 異咯嗪光敏劑的結構

2 結果

MTT法研究了異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制率影響。圖2顯示異咯嗪光動力能明顯抑制Bel-7402細胞，在光照60 min后，異咯嗪表現出對Bel-7402細胞極強的殺傷能力，其抑制率達到70%左右。此外，MTT染色顯示：未經異咯嗪光動力處理的Bel-7402細胞MTT染色后，在細胞內及細胞周圍生成分布比較均勻的紫藍色Formazan結晶（圖3A）；而Bel-7402細胞經過經異咯嗪光動力作用后，細胞數目明顯降低，細胞結構遭到破壞，細胞失去了還原MTT能力，導致紫藍色結晶明顯減少，細胞處于調亡和壞死狀態（圖3B）。

圖2 MTT法分析異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制率

圖3 MTT染色分析異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用

3 討論

一些研究顯示異咯嗪光動力對腫瘤細胞的抑制作用[7-8]，然而異咯嗪光動力對Bel-7402細胞的抑制作用還鮮見報道。因此，在該研究通過MTT染色法研究了異咯嗪光動力對Bel-7402細胞作用。結果顯示，異咯嗪光動力能明顯抑制Bel-7402細胞增殖。作用機理可能是：腫瘤細胞攝入的異咯嗪（A）在特定波長激發后，通過系間竄躍，基態的A變為激發三線態（3A*）；3A*與H2O和O2反應，或與三線態氧（3O2）反應，產生過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）、超氧負離子自由基（·O-2）、單線態氧（1O2）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）；ROS與細胞膜內外的生物大分子(如蛋白質、酶類和脂類等)發生氧化反應，從而導致Bel-7402細胞凋亡或壞死。該過程可用如下反應式表示：

[1]Lu K,He C,Lin W.Nanoscale metal-organic framework for highly effective photodynamic therapy of resistant head and neck cancer[J].J Am Chem Soc,2014,136(48):16712-16715.

[2]Li X,Zhou ZP,Hu L,et al.Apoptotic cell death induced by 5-aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy of hypertrophic scar-derived fibroblasts[J].J Dermatolog Treat, 2014,25(5):428-433.

[3]Akens MK,Wise-Milestone L,Won E,et al.In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy on metastatic breast cancer cells pre-treated with zoledronic acid[J].Photodiagnosis and photodynamic therapy,2014,11(3):426-433.

[4]Park K.J.,Lee C.H.,Kim A,et al.S.Death Receptors 4 and 5 Activate Nox1 NADPH Oxidase through Riboflavin Kinase to Induce Reactive Oxygen Species-mediated Apoptotic Cell Death[J].The Journal of Biological Chemistry,2012,287(5): 3313-3325,.

[5]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Comparison of UVA-and UVA/riboflavin-induced growth inhibition of A-canthamoeba castellanii[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2013,251(2):509-514.

[6]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Evaluation of antibacterial efficacy of photo-activated riboflavin using ultraviolet light(UVA)[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2010,248(2):207-212.

[7]Machado D,Shishido S.M,Queiroz K.C,et al.Irradiated riboflavin diminishes the aggressiveness of melanoma in vitro and in vivo[J].PLoS One,2013,8(1):E54269.

[8]De Souza Queiroz K.C.,Zambuzzi W.F.,Santos de Souza A. C,et al.A possible anti-proliferative and anti-metastaic effect of irradiated riboflavin in solid tumors[J].Cancer Letters, 2007，258(1):126-134.

Inhibition Effect of MTT Method in Detecting the Isoalloxazine Photodynamic on the Bel-7402 Cells

XIA Chun-hui,WANG Yu,CHEN Yu-hang,SUN Dong-sheng,FU Shuang,LI Hong-mei
Pharmacy College,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang Province,161006 China

ObjectiveTo research the inhibition effect of MTT method in detecting the isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells.MethodsThe inhibition effect of isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells was measured by the MTT method.ResultsThe isoalloxazine photodynamic can obviously inhibit the Bel-7402 cells.ConclusionIsoalloxazine is a potential photosensitizer.

Isoalloxazine;Photodynamic;Apoptosis;Bel-7402 cells

R735.7

A

1672-5654（2017）01（c）-0047-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.03.047

2016-10-23）

齊齊哈爾市科學技術計劃項目（SFGG-201206）。

夏春輝（1969.12-），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，教授，研究方向：功能材料制備與抗腫瘤機制研究。