酵母菌發酵玉米皮制備菌體蛋白飼料

王雅波，劉占英，蘭 輝，李永麗，劉艷新

（內蒙古工業大學化工學院，內蒙古呼和浩特 010050）

資源開發利用

酵母菌發酵玉米皮制備菌體蛋白飼料

王雅波，劉占英*，蘭 輝，李永麗，劉艷新

（內蒙古工業大學化工學院，內蒙古呼和浩特 010050）

玉米皮是玉米加工過程中的主要副產品，其營養價值豐富，可作為緩和資源短缺和降低工業成本的優質飼料來源，但目前各玉米淀粉廠對其的綜合利用不夠完全，導致部分資源浪費。本文采用飼料國標測定法對玉米皮中纖維素類等有效成分進行測定，并以玉米皮為原材料，采用畢赤酵母菌2.3250發酵的方法降解玉米皮中的纖維素類物質，使其充分轉化為高附加值的飼料蛋白。結果表明：玉米皮中的纖維素和半纖維素含量分別為16.40%和47.68%，蛋白質含量為11.49%，淀粉含量為15.50%，脂肪含量為2.73%，木質素含量為5.41%。另外，利用畢赤酵母菌轉化玉米皮時，在無蛋白胨添加的情況下，25℃恒溫培養48h，畢赤酵母菌濃度最高，為2.31×107個/m L。經過微生物發酵，玉米皮中纖維素含量由16.40%降到6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%。該研究對玉米皮的重要組分進行了系統分析，為利用酵母菌發酵玉米皮生產高附加值的菌體蛋白飼料等后續研究奠定了基礎。

玉米皮；酵母；菌體蛋白飼料

玉米是我國的主要糧食作物之一，我國現今擁有幾百家玉米淀粉加工廠。玉米皮是玉米淀粉加工的主要副產物之一，大約占玉米總質量的12%（史建國，2007），但玉米皮并未得到充分利用，產品附加值極低，導致主產品成本增高，利潤率下降，市場競爭力變弱及社會效益降低等。因此更深層次的開發利用玉米的深加工副產物玉米皮（丁聲俊，2011），可帶動玉米加工企業的經濟效益。與此同時，因飼料工業存在飼料蛋白供不應求的現象，僅依靠生產以往使用的蛋白類飼料根本無法滿足飼料生產迅速發展的需求，而發展微生物飼料蛋白是滿足其需要的有效途徑之一 （代養勇等，2011），并且玉米皮是該產業的首選原材料。孫付保等（2010）利用混合菌株固態發酵玉米皮生產飼料蛋白，張博潤等（1997）利用白地霉Z-4、熱帶假絲酵母Z-14和木素木霉Z-203菌株混合發酵白酒糟生產飼料蛋白，但這些產纖維素酶的微生物大多數是真菌，而酵母菌與其相比更具色、香、味和較高的蛋白質含量，發酵過程中耐酸能力強，不易污染，回收率高等優點，是生產微生物蛋白飼料的首選菌種（陳曉萍，2009）。因此，本文利用酵母菌將玉米皮轉化為優質飼料，旨在有效利用玉米皮的營養成分，為菌體蛋白飼料研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料 玉米皮購于內蒙古阜豐科技有限責任公司，其他化學試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌種 畢赤酵母菌，為本實驗室前期篩選得到的最佳菌種。

1.1.3 儀器與設備 高效液相色譜Water 1515；色譜柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm id，9μm）；RI示差檢測器；流動相：8 mmol/L H2SO4；進樣體積：20μL；流動相流速：0.5 mL/min；柱溫：40℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米皮成分的測定

纖維素、半纖維素含量的測定：范式測定纖維含量法（馮繼華等，1994）。

木質素含量的測定：飼料中酸性洗滌木質素的國標測定方法（GB/T 20805-2006）。

粗蛋白質含量的測定：飼料中粗蛋白質的國標測定方法（GB/T 6432-94）。

淀粉含量的測定：測淀粉含量的國標方法—酶水解法（郭冬生等，2007）。

脂肪含量的測定：測脂肪含量的國標方法—索氏提取法（GB/T 6433-2006），以及酸水解法（李秀花，1994）。

1.2.2 酵母菌發酵玉米皮制備飼料蛋白 厭氧培養需取24個30mL西林瓶，稱取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸餾水；好氧培養需取24個100 mL三角瓶（提前洗凈，烘干），均稱取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸餾水，蓋膠塞，壓鋁蓋后放入1.5 MPa，121℃壓力鍋中滅菌。在操作前，需先在超凈工作臺內殺菌30min，再接入1.5mL酵母菌液（5%接菌量），置于25℃，150 r/min的培養箱內培養菌種。每24個瓶培養一個時間梯度，分別為24、48 h。觀察不同培養時間和需氧情況對畢赤酵母菌體的影響。

1.2.3 微生物飼料中菌體濃度測定 將培養好的菌液置于振蕩器上振蕩5 min，使菌落脫離玉米皮。再將菌液倒入離心管中，3000 r/min離心5min（張國華等，2008）。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度計內，測定OD560。

1.2.4 微生物飼料中菌體數測定 由于原菌液濃度太大，給計數帶來極大不便，故需預先稀釋。本次所采用的稀釋方法為：準備數個裝有9 mL蒸餾水30mL西林瓶，取1mL菌液添加到一個西林瓶中，依此梯度稀釋5個濃度，考慮到在操作過程中容易染菌，所以使用壓過蓋的西林瓶稀釋，然后再利用血球板計數（沈萍等，2007）。

1.2.5 乙醇產量的測定

1.2.5.1 流動相配制 先用抽濾瓶抽取少量二次水，清洗抽濾瓶內壁，將清洗后的水倒出。再用抽濾瓶抽取約1000 mL二次水后，再用超聲波清洗器超聲0.5 h，之后將其內的屈臣氏水加入到儀器儲液瓶中。

1.2.5.2 標準樣品的配置 乙醇2 g，72%的硫酸溶液5mL，最后用二次水稀釋到1 L。

1.2.5.3 樣品溶液的配制 取培養好的菌液上清液950μL和50μL的10%的硫酸溶液加入到離心管中，4℃、15000 r/min冷凍離心3min。取出上清液置于另一離心管中，在上述同樣的條件下再離心3 min，同樣取出上清液經0.22μm水相過濾頭過濾后置于進樣瓶中，開始測樣。

2 結果與分析

2.1 玉米皮組分的分析 玉米皮組分含量見表1，纖維素含量約為24.80%、半纖維素含量為47.68%、蛋白質含量為 11.49%、淀粉含量為15.50%、脂肪含量為2.73%以及木質素含量為5.41%。這與Palmarola-Adrados等（2005）的研究近乎相同。

2.2 酵母菌發酵玉米皮制備飼料蛋白

2.2.1 培養條件對菌種濃度的影響 由表2可知，厭氧條件下培養48 h時，畢赤酵母菌體個數為2.31×107個/mL，相較于其他培養條件下，菌體濃度最高。

表1 玉米皮組成及含量%

表2 培養條件對菌體濃度的影響

2.2.2 蛋白胨添加量對菌種濃度的影響 由表3可知，蛋白胨添加量為0 g時，畢赤酵母菌體數量為2.31×107個/mL，高于其他條件下培養的菌體數量。

表3 蛋白胨添加量對菌種濃度的影響

2.2.3 纖維素與半纖維素的降解率 通過以上試驗結果得知，在以玉米皮為底物時，厭氧培養48 h以后的菌液濃度明顯高于24 h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，所以對該條件下培養后的剩余培養基中的纖維素和半纖維素成分進行測定，結果見表4。

表4 纖維素和半纖維降解率%

經過微生物發酵，玉米皮中纖維素含量由16.40%變到6.22%，半纖維素含量由47.68%變到33.45%，說明畢赤酵母菌使玉米皮中的纖維素和半纖維素得以降解，供己所需，這可能是由于畢赤酵母菌產生某種可降解纖維素的酶。隨著營養成分的不斷增加，菌體濃度也會隨之上升，與培養48 h菌體濃度高于24 h結論一致。

2.2.4 乙醇產量 經高效液相色譜測定，得到并無乙醇產生。

3 討論與小結

Javed等（2012）研究發現，玉米皮中含有豐富的纖維類物質，其中包括有30%～50%的半纖維、10%～20%纖維素以及微量的木質素。本試驗結果表明，玉米皮中的纖維類物質含量很高，其中纖維素含量為16.40%，木質素含量為5.41%，而半纖維素含量高達47.68%，淀粉含量為15.50%，蛋白質含量為11.49%，在測量時會因原料的產地及種類不同略有差異。另外，畢赤酵母菌可以有效的發酵玉米皮，通過顯微鏡直接計數法和分光光度法均證實，在以玉米皮為底物時，厭氧培養48 h以后的菌液濃度明顯高于24 h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，這一現象可能是由于在起初接入畢赤酵母菌時，首先會利用一部分木糖維持，以致培養前期酵母處于延遲期生長，菌體數目增加不明顯，同時木糖的消耗較少（陳曉萍，2009）；培養后期酵母處于指數生長期，酵母數急劇增加，同時開始消耗玉米皮中的纖維素。對剩余培養基成分進行測定發現，玉米皮中纖維素含量由16.40%降到6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%，遠高于喬君毅（2008）研究的纖維素和半纖維素的降解率水平，達到了玉米皮成分得以轉化的效果，在發酵過程中并未產生乙醇等影響飼料生產的有毒物質，符合其作為微生物飼料的基本要求。

[1]陳曉萍.副產物玉米皮固態發酵高值化的研究：[碩士學位論文][D].無錫：江南大學，2009.

[2]代養勇，董海洲，王志剛，等.我國玉米深加工產業現狀及發展趨勢[J].中國食物與營養，2011，17（4）：37～39.

[3]丁聲俊.發展玉米深加工業應掌握適度 [J].糧食與食品工業，2011，18 （4）：1～4.

[4]馮繼華，曾靜芬，陳茂椿，侯正高.應用VanSoest法和常規法測定纖維素及木質素的比較[J].西南民族學院學報（自然科學版），1994.1.

[5]郭冬生，彭小蘭.蒽酮比色法和酶水解法兩種淀粉測定方法的比較研究[J].湖南文理學院學報（自然科學版），2007.3.

[6]李秀花.酸水解法測定食品中脂肪含量與索氏抽提法的比較[J].山西醫科大學學報.1999，4.

[7]喬君毅，亢晉，張福元，等.黑曲霉發酵玉米秸稈產纖維素酶的研究[J].飼料研究，2008，12：63～66.

[8]沈兆兵，劉曉潔，劉莉等.拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052發酵玉米皮生產丁醇[J].2014，5：361～367.

[9]沈萍，陳向東.微生物學實驗[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[10]史建國.基于SPCE061A型單片機的食品螺桿膨化機溫度的檢測與控制：[碩士學位論文][D].濟南：山東大學，2007.

[11]孫付保，陳曉旭，陳曉萍等.混合菌株固態發酵玉米皮生產飼料蛋白[J].食品與生物技術學報，2010，29（6）：916～920.

[12]王良倉.玉米皮的綜合利用[J].中文信息，2013.6.

[13]張國華，考桂蘭，李寶棟，等.酵母菌紫外誘變時洗滌液與離心轉速的選擇[J].畜牧與飼料科學，2008，29（3）：40～42.

[14]張博潤，劉玉方，何秀萍等.發酵飼料蛋白的培養條件及產物分析[J].微生物學報，1997，37（4）：281～284.

[15]GB/T 20805-2006飼料中酸性洗滌木質素（ADL）的測定.

[16]GB/T 6432-94飼料中粗蛋白的測定方法.

[17]GB/T 6433-2006/ISO 6492：1999飼料中粗脂肪的測定.

[18]Holguin-Acuna A L，Carvajal-M illan E，Santana-Rodriguez V，et al. M aize bran/oat flour extruded breakfast cereal：A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant[J].Food Chem istry，2008，111（3）：654～657.

[19]Javed M M，Zahoor S，Shafaat S，et al.W heat bran as a brown gold：Nutritious value and itsbiotechnological applications[J].African Journal of M icrobiology Research，2012，6（4）：724～733.

[20]M endon?a S，Grossmann M V E，VerhéR.Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks[J].LWT-Food Science and Technology，2000，33（1）：2～8.

[21]Palmarola-Adrados B，Borska P C，Galbe M，et al.Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat bran[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：843～50.

[22]W u Y V，Norton R A.Enriehment of Protein，starch，fat，and sterol ferulates from corn fiber by fine grinding and air elassifieation[J].Industrial Crops and Produets，2001，14（2）：135～13.■

Corn bran is themain by-product of the corn，which riches in nutritional value.As a high quality source of feed，corn bran can ease the shortage of feed resource and reduce the cost of feed industry.However the comprehensive utilization of the corn starch plant is completely inadequate，resulting in partof thewaste of resources.This paper aims to determinate the effective components of corn husk cellulose by the feed national standard method，and takingmaize peel as raw material，degrade corn husk cellulose material to make it fully into high value-added feed protein using Pichia pastoris 2.3250 fermentation method.The experimental results showed that the contents of cellulose and hemicellulose in corn bran were 16.40%and 47.68%respectively，and the protein contentwas 11.49%，the starch contentwas 15.50%，the fat content was 2.73%and the lignin contentwas 5.41%.When using the Pichia pastoris transformed corn skin components，in the absence of peptone added，culture for 48 h in the temperature was 25℃，microbial feed protein concentration is the highest，and the yeast cell number was 2.31×107/mL，the content of cellulose decreased from 16.40%to 6.22%，the hemicellulose contentdecreased from 47.68%to 33.45%.The study systematic analysis the important components of corn，and laid the foundation for the further research on the production ofhigh added value ofbacterial protein feed by using yeast fermentation.

corn bran；yeast；microbial protein feed

S816.4

A

1004-3314（2017）04-0031-03

國家自然科學基金項目（61361016）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（2013151412000）；內蒙古自治區草原英才工程項目；內蒙古自治區高等學校青年科技英才支持計劃項目

*通訊作者

DO I：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170408