脂氧素受體激動劑BML-111對慢性神經病理性疼痛大鼠治療的研究

陳永梅 彭春艷 龔興瑞 秦成名

脂氧素受體激動劑BML-111對慢性神經病理性疼痛大鼠治療的研究

陳永梅 彭春艷 龔興瑞 秦成名?

目的 觀察脂氧素受體激動劑BML-111對L5/6脊神經結扎術后大鼠的鎮(zhèn)痛效果。方法 選擇Wistar大鼠作為實驗動物，建立L5/6脊神經結扎動物模型。觀察鞘內給予不同劑量的BML-111對機械痛和熱痛的抑制作用。鞘內給予100μg/kg BML-111并檢測對患側脊髓腰膨大部位IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響。結果 BML-111劑量依賴性抑制對L5/6脊神經結扎所導致的神經病理性疼痛；其機械痛和熱痛最大抑制率分別是67%和69%；半數有效量分別為16μg/kg和22μg/kg。鞘內給予100μg/kg BML-111可有效降低患側脊髓腰膨大部位IL-1β，IL-6，TNF-α含量（P＜0.05）。結論 脂氧素受體激動劑BML-111可有效減輕L5/6脊神經結扎術后大鼠神經病理性疼痛，其機制可能與抑制脊髓背角炎癥反應有關。

BML-111 L5/6脊神經結扎術 神經病理性疼痛 大鼠

慢性神經病理性疼痛是臨床常見疾病，主要表現為局部疼痛過度敏感，包括機械性和熱痛覺過敏，最終可導致抑郁，工作能力喪失等不良后果［1］。目前臨床治療主要采用阿片類藥物及5羥色胺受體阻斷劑和去甲腎上腺素再攝取抑制劑進行治療，但效果并不滿意［2］。而慢性神經病理性疼痛的主要機制是脊髓背角炎癥反應，進而敏化神經元，因此抑制炎癥反應對治療慢性神經病理性疼痛具有重要意義［3］。在之前的研究中作者發(fā)現BML-111在體內具有重要的抗炎作用［4-5］。2015年4月至10月作者通過實驗研究，觀察脂氧素受體激動劑BML-111對慢性神經病理性疼痛大鼠的作用，并初步分析其可能機制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇健康雄性Wistar大鼠，由湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心提供，試驗時遵守NIH動物保護條例。所有大鼠自由進食水，光照和黑夜比為12h：12h（每天早晨8點開燈）。IL-1β，IL-6，TNF-α用ELISA 試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2 實驗方法 （1）實驗分組與模型建立：將5mg氟哌利多與100ml水合氯醛混合，按照3ml/100g的劑量對大鼠行腹腔注射麻醉，動物麻醉后將其固定于手術臺上，術中持續(xù)面罩給氧。按照文獻介紹的方法建立脊神經結扎模型［6］，將大鼠背部毛發(fā)剃除后，噴灑酒精消毒，正中切開腰骶部皮膚，將PE10號管置入鞘內，從頸部皮膚穿出后固定于頸部，方便給藥。分離椎旁筋膜，暴露椎板后將L5椎板下部剪除，可見L5脊神經位于偏內側，從骶骨邊緣處勾出L6脊神經，將L5、6脊神經結扎。縫合筋膜、皮膚，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。模型建立后2周將大鼠取出測量其基礎閾值，患側基礎值＜10g且無對側異常痛覺過敏現象。向大鼠鞘內注射2%利多卡因10μl，如大鼠未出現雙后肢癱瘓，則排除。假手術組只切開皮膚，分離筋膜，暴露但不結扎神經。將符合條件的大鼠隨機分入各實驗組，每組各6只，分別鞘內給予生理鹽水1、10、30、100、300μl/kg，觀察其最大鎮(zhèn)痛效果，并計算其疼痛最大抑制率。（2）行為學檢測：機械痛測量時將動物放于網狀支架上，長方形塑料盒內，適應15min后開始測量，將機械痛測量儀（IITC Life Science Inc，CA，USA）鈍頭以緩慢相同力量刺激患側及健側，如出現快速的縮足反應，則將當時顯示器上的數值記錄為縮足閾值，測量3次求其平均值。熱痛測量時將大鼠放于透明玻璃上方的長方形塑料盒內，適應15min，將儀器發(fā)射的熱光源分別照射大鼠雙側足底，記錄出現縮足反射時的閾值，并測量3次求平均值。（3）IL-1β、IL-6、TNF-α含量的測定：將100μg/kg BML-111注射大鼠鞘內，并用15μl生理鹽水沖洗，保證藥物進入鞘內。2h后處死大鼠，將腰膨大部位的脊髓分離并取患側，分離筋膜并用生理鹽水沖洗干凈，加入生理鹽水磨碎，離心后取上清液，根據說明書用ELISA法測量肺組織勻漿IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad軟件，統(tǒng)計方法選擇單因素方差分析，最大抑制率（%，MPE）=（患側最大值-患側基礎值）/（對側值-患側基礎值），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

鞘內注射BML-111劑量依賴性抑制L5、6脊神經結扎術后神經病理性疼痛，藥物達峰時間位于鞘內注射后約2h，注射8h后鎮(zhèn)痛作用基本消除，BML-111對機械痛的最大抑制率為67%，半數有效量（ED50）為16μg/kg；對熱痛的最大抑制率為69%，半數有效量（ED50）為22μg/kg。ELISA檢測結果發(fā)現相比假手術組，脊神經結扎增加IL-1β、IL-6、TNF-α的表達（P＜0.05），而給予BML-111可有效降低其含量（P＜0.05），而給予生理鹽水不影響IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。見圖1-2。

圖1 BML-111劑量依賴性抑制脊神經結扎后大鼠的機械痛（A）和熱痛（B），及機械痛（C）和熱痛（D）量效曲線

圖2 鞘內注射100μg/kg BML-111后2h脊髓患側IL-1β（A），IL-6（B），TNF-α（C）表達情況。（A、B分別表示與假手術組和脊神經結扎組比較：P＜0.05）

3 討論

慢性神經病理性疼痛是一種脊髓慢性炎癥性疾病，其脊髓背角炎癥因子升高可敏化脊髓神經元導致痛覺過敏，從而導致慢性疼痛。其炎癥因子來源主要為脊髓背角小膠質細胞和星形膠質細胞，其被激活后釋放一系列炎癥因子。本資料結果顯示，與假手術組比較，脊神經結扎后IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，表明神經病理性疼痛大鼠患側脊髓背角存在明顯的炎癥反應。

脂氧素是重要的促進炎癥消退的物質，減少炎癥介質的局部濃度。在本實驗中發(fā)現鞘內給予BML-111劑量依賴性抑制由脊神經結扎所誘發(fā)的神經病理性疼痛，其效果確切，最大疼痛抑制率達70%左右。鞘內注射后可有效降低同側IL-1β，IL-6，TNF-α的含量，因此作者推測其鎮(zhèn)痛作用主要與抑制炎癥反應，降低炎癥因子含量有關。在以往的試驗中也發(fā)現激活脂氧素受體可有效抑制IL-6，TNF-α炎癥因子的分泌，且可增加體內IL-10的含量，從而發(fā)揮其抗炎效果［7-9］。且最近一篇報道顯示鞘內直接脂氧素A4注射也發(fā)現有明顯的抑制疼痛作用，且其鎮(zhèn)痛機制與抑制TNF-α釋放有關［10］。由于慢性神經病理性疼痛中炎癥因子的產生主要是小膠質細胞和星形膠質細胞［11］，因此BML-111可能主要作用于小膠質細胞和星形膠質細胞［12］。其作用機制可能抑制與PI3-K、p38和p42/44 MAPK、NF-kB和AP-1信號轉導途徑有關［13］。但由于脂氧素半衰期較短，因此實驗中采用脂氧素受體激動劑BML-111鞘注射，產生明顯抑制炎癥因子釋放的作用，產生效果類似。

神經病理性疼痛產生后，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高，其主要來自于神經系統(tǒng)的膠質細胞，因此在實驗中被用作慢性神經病理性疼痛產生后脊髓炎癥因子的標志［14］。慢性神經病理性疼痛傳統(tǒng)仍較多使用阿片類藥物治療，但容易產生耐受，呼吸抑制等問題，且長期使用后可導致疼痛敏感化，因此臨床療效受到質疑［15］。在本資料中，根據慢性神經病理性主要是病理特征炎癥導致的疼痛敏化，采用促進自身機體炎癥反應消退的方法抑制神經病理性疼痛，這種方法具有較好的應用前景，且克服阿片類藥物的副作用。

總之采用BML-111鞘內單次注射可有效抑制神經病理性疼痛，成本較低，成功率高，具有較好的應用前景。作者將進一步明確BML-111作用于膠質細胞信號通路，進而為臨床使用此藥物治療神經病理性疼痛提供參考。

［1］ Basbaum AI, Bautista DM, Scherrer G, et al.Cellular and Molecular Mechanisms of Pain. Cell, 2009, 139： 267-284.

［2］ Kimura M, Obata H, Saito S. Peripheral nerve injury reduces analgesic effects of systemic morphine via spinal 5-hydroxytryptamine 3 receptors. Anesthesiology, 2014, 121： 362-371.

［3］ Gao YJ, Zhang L, Samad OA, et al. JNK-Induced MCP-1 Production in Spinal Cord Astrocytes Contributes to Central Sensitization and Neuropathic Pain. Journal of Neuroscience, 2009, 29： 4096-4108.

［4］ 陳永梅, 張昭勇, 陳玲, 等.BML-111對野百合堿致大鼠肺組織白介素-1β和組織因子的影響. 海南醫(yī)學, 2015： 1566-1568

［5］ 陳永梅, 張昭勇, 陳玲, 等. BML-111對野百合堿致大鼠肺動脈高壓的作用及其機制的研究. 浙江臨床醫(yī)學, 2015, 3： 340-341.

［6］ Chung JM, Kim HK, Chung K. Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain. Methods Mol Med, 2004, 99： 35-45.

［7］ Baker N, O'Meara SJ, Scannell M, et al. Lipoxin A4： antiinflammatory and anti-angiogenic impact on endothelial cells. J Immunol, 2009, 182： 3819-3826.

［8］ Xu Z, Zhao F, Lin F, et al. Lipoxin A4 inhibits the development of endometriosis in mice： the role of anti-inflammation and antiangiogenesis. Am J Reprod Immunol, 2012, 67： 491-497.

［9］ Walker J, Dichter E, Lacorte G, et al. Lipoxin A4 increases survival by decreasing systemic inflammation and bacterial load in sepsis. Shock 2011, 36： 410-416.

［10］ Abdelmoaty S, Wigerblad G, Bas DB, et al. Spinal actions of lipoxin A4 and 17(R)-resolvin D1 attenuate inflammationinduced mechanical hypersensitivity and spinal TNF release. PLoS One, 2013, 8： e75543.

［11］ Ji R, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain： Is chronic pain a gliopathy. PAIN, 2013, 154, Supplement 1： S10-S28.

［12］ Martini AC, Berta T, Forner S, et al. Lipoxin A4 inhibits microglial activation and reduces neuroinflammation and neuropathic pain after spinal cord hemisection. Journal of Neuroinflammation, 2016, 13.

［13］ Wu SH, Liao PY, Dong L, et al. Signal pathway involved in inhibition by lipoxin A(4) of production of interleukins induced in endothelial cells by lipopolysaccharide. Inflamm Res, 2008, 57：430-437.

［14］ Calvo M, Dawes JM, Bennett DL.The role of the immune system in the generation of neuropathic pain. The Lancet Neurology, 2012, 11： 629-642.

［15］ Caraceni A, Hanks G, Kaasa S, et al. Use of opioid analgesics in the treatment of cancer pain： evidence-based recommendations from the EAPC. Lancet Oncol, 2012, 13： e58-68.

Objective To test the effect of BML-111 on neuropathic pain induced by L5/6 spinal nerve ligation. Methods Wistar rats were used for establishment of rats L5/6 spinal nerve ligation model. Mechanical paw withdrawal threshold and thermal paw withdrawal threshold were measured after intrathecal injection of different dose BML-111. Two hours after the intrathecal injection of 100ug/kg BML-111，the rats ipsilateral spinal cord lumbar enlargement were acquired and measured for IL-1β，IL-6，TNF-α. Results BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior with maximum possible effect（67%）and ED50（16μg/kg）for mechanical stimulation；69% and 22μg/kg for thermal stimulation. 100μg/ kg BML-111 reduced IL-1β，IL-6，TNF-α concentration in ipsilateral spinal cord（P＜0.05）. Conclusions BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior，the reason may be attribute to the reduction of the infl ammatory mediators production.

BML-111 L5/6 spinal nerve ligation Neuropathic pain Rats

湖北省十堰市科技局指導項目（ZD20111016）

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院

*通信作者