辛伐他汀減輕蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的機制研究

李 楊，石伏軍，張 健

蛛網膜下腔出血(SAH)是嚴重危及生命的常見腦血管意外，10%～15%的卒中患者在入院前死于SAH[1]。腦血管痙攣(CVS)作為SAH常見而危險的并發癥，是SAH后致死致殘的主要原因，一旦發生，難以逆轉[2]。研究表明，在CVS的病理生理過程中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-8、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)參與血管內皮細胞的損傷[3]。辛伐他汀是臨床常用的調脂藥物，研究發現其可預防 SAH后遲發性 CVS發生，但其機制還未明確[4]。本研究以免SAH模型為基礎，探討辛伐他汀對兔SAH后遲發性腦血管痙攣期血管內皮細胞TNF-α、IL-6、IL-8和eNOS水平的影響，明確辛伐他汀預防SAH后遲發性CVS的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司)，β-actin(Invitrogen公司)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)，過硫酸銨(GIBICO公司)，IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗分組及模型建立：健康成年雄性新西蘭大白兔36只，體重2 200～3 200 g，購于寧夏醫科大學實驗動物中心。隨機分為3組：①SAH組(SAH)，常規飼養，從枕骨大孔處穿刺進入蛛網膜下腔，注入自體動脈血 1 mL/kg建立蛛網膜下腔出血模型，48 h后以相同方式再次注血；②SAH+辛伐他汀組(SAH+ SVT組)，常規飼養，連續7 d每天給予辛伐他汀 5 mg/kg胃灌，后與SAH組以相同方式處理；③假手術組(Sham組)，常規飼養，于相同時間點給予等量生理鹽水。

1.3 標本采集：常規麻醉開胸，經主動脈灌注生理鹽水 (37 ℃) 300 mL和4%多聚甲醛200 mL。取新鮮基底動脈及周圍腦干組織置于冰生理鹽水，立體顯微鏡下分離基底動脈，生理鹽水沖洗血管內殘留血液，將標本置于液氮中2 min，再放入-70 ℃冰箱保存備用。

1.4 免疫組織化學法：石蠟切片常規脫蠟至水，采用SP法，高壓修復抗原8 min，后續按二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書步驟操作。蘇木素復染，梯度脫水，中性樹膠封片。

1.5 Western blot法：按蛋白提取試劑盒說明提取兔基底動脈組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影后將X線片掃描入凝膠成像系統進行灰度值分析。

2 結果

2.1 辛伐他汀對基底動脈壁TNF-α表達的影響:采用免疫組化法檢測基底動脈壁TNF-α表達變化，結果顯示，SAH+SVT組基底動脈痙攣減輕，與SAH組相比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1-圖4(目錄后)，TNF-α表達明顯降低；SAH+SVT組與Sham組TNF-α表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 辛伐他汀對基底動脈壁IL-6和IL-8水平的影響：采用ELISA法檢測基底動脈壁IL-6和IL-8水平，結果顯示，與SAH組相比較差異有統計學意義(P<0.05)；SAH+SVT組基底動脈壁IL-6和IL-8水平均明顯降低。SAH+SVT組與Sham組IL-6和IL-8水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 辛伐他汀對基底動脈壁eNOS表達的影響：采用Western blot法檢測基底動脈壁eNOS蛋白表達變化，結果顯示，與SAH組相比較差異有統計學意義(P<0.05)；SAH+SVT組基底動脈壁eNOS蛋白表達明顯降低。SAH+SVT組與Sham組eNOS蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

CVS是SAH最常見且嚴重的并發癥，常見于蛛網膜下腔中較大的動脈強烈收縮，是動脈瘤破裂死亡的主要原因之一[5]。據統計，在所有SAH病例中高達50%是致命性的，而存活的患者常伴隨神經系統或認知障礙。CVS發病機制復雜，有研究證實，炎癥反應可能在其發展過程中發揮重要作用[6]。

目前研究表明，CVS是由于血管舒張與收縮平衡失調所致，其中eNOS是調控血管功能的關鍵酶，其介導內皮依賴性血管舒張反應下降并在炎癥反應中發揮重要作用，有實驗證實，一氧化氮(NO)替代治療可逆轉CVS[7- 8]。實驗表明，SAH后eNOS mRNA和eNOS蛋白水平均下降，SAH大鼠的體外實驗表明內皮功能障礙與eNOS蛋白的表達下降有關[9]。此外，大量實驗和臨床證據提示，炎癥反應參與了SAH后CVS的發生和發展。在SAH尸檢和犬SAH模型中，可見基底動脈內膜、中膜及蛛網膜下腔內嗜中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，且SAH后炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等表達水平明顯增加。同時Wu Wei等的研究表明，腦動脈周圍的嚴重炎癥可導致中至重度的持續CVS[10]。Clatterbuck等研究發現，給猴SAH模型靜脈應用抗CDll/CD18單克隆抗體可明顯降低CVS的發生[11]。TNF-α是機體參與炎癥和免疫應答反應的重要因子，其誘導內皮細胞和白細胞產生黏附分子，增強后者對毛細血管內皮的黏附力，引起白細胞脫顆粒釋放自由基、蛋白酶和毒性代謝產物，誘發級聯反應，從而損傷炎癥區域細胞[12-13]。有研究證實，TNF-α在急性SAH的病理生理過程中參與了這種損傷作用，且TNF-α水平變化與患者基底動脈血流量變化在時間和程度上相一致[14]。辛伐他汀能抑制內源性膽固醇合成，目前臨床上已被廣泛用于治療高脂血癥。隨著他汀類新藥的不斷開發，其抗炎、抗氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖及調節內皮細胞功能等作用也越來越被國內外學者關注和認可[15]。因此，辛伐他汀可能是通過抑制炎性因子表達，減輕SAH后血管局部炎癥反應，從而緩解CVS。

本研究顯示，辛伐他汀能夠減輕基底動脈痙攣，下調TNF-α和eNOS蛋白表達，同時降低IL-6和IL-8水平，這進一步證實辛伐他汀可通過抑制炎性細胞因子表達，降低 SAH 后血管壁局部的炎癥反應，減少組織損傷，維持血管正常功能，緩解CVS，其更為詳細的作用機制有待我們進一步研究。

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