肝纖維化新型分子診斷標志物

杜靜華， 南月敏

(河北醫科大學第三醫院 中西醫結合肝病科， 石家莊 050051)

肝纖維化新型分子診斷標志物

杜靜華， 南月敏

(河北醫科大學第三醫院 中西醫結合肝病科， 石家莊 050051)

肝纖維化是各種慢性肝病進展為肝硬化的重要病理階段，及時準確的評估肝纖維化程度，對指導慢性肝病的治療具有重要意義。隨著分子生物學技術的發展及分子診斷技術在臨床的廣泛應用，新型血清分子診斷標志物的檢測將有助于肝纖維化的早期診斷及精準治療。近年研究發現并經臨床驗證有診斷價值的血清新型分子標志物包括成纖維細胞因子、基質金屬蛋白酶及其抑制物、細胞外基質相關標志物、非編碼RNA等。此外，基因組學、蛋白質組學、代謝組學等分子組學檢測亦有診斷意義。

肝硬化； 生物學標記； 診斷

肝纖維化是機體對各種病因引起的慢性肝損傷的一種修復反應，是慢性肝病進展為肝硬化的重要病理階段[1]。準確診斷肝纖維化病期、進展情況，選擇有效阻止肝纖維化的治療策略、正確判斷療效是預防終末期肝病發生的重要手段。肝纖維化的臨床診斷方法包括肝穿刺活組織檢查、血清分子標志物、瞬時彈性成像及影像學技術[2]。肝穿刺活組織檢查是肝纖維化分期診斷的金標準，但存在有創性、樣本誤差等局限性。瞬時彈性成像近年應用廣泛，但肝臟炎癥、膽汁淤積等均有一定的影響。近年來血清分子生物學標志物在肝纖維化診斷中的應用已成為研究的熱點。理想的肝纖維化分子標志物應具有肝臟特異性高、能夠反映細胞外基質(ECM)沉積和降解的動態平衡，有助于肝纖維化早期診斷及監測其進程等特點。此外，其檢測技術精確、方法簡便，具有良好的可重復性。

常用的檢測肝纖維化的血清標志物主要分為直接和間接標志物兩大類，應用較多的直接標志物為透明質酸、Ⅰ型和Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原等[3]；間接標志物包括血清ALT、AST、凝血功能和血小板計數等。上述標志物均與肝臟炎癥活動、肝臟代謝等狀態有關，不能準確反映肝纖維化程度[4]。隨著分子診斷技術逐步研發并應用于臨床，新型血清分子標志物不斷涌現，主要包括成纖維細胞因子、基質金屬蛋白酶及其抑制物、ECM相關標志物、非編碼RNA、分子組學等。

1 成纖維細胞因子

肝纖維化的發病機制復雜，受到多種細胞-細胞、因子-因子相互制約，構成肝纖維化調節的一個龐大網絡體系。因此，肝纖維化形成和發展過程中，關鍵細胞因子的活性及表達水平與肝纖維化的進展、病變程度相關。近年來，隨著肝纖維化機制研究的不斷深入，一些新型成纖維細胞因子逐漸受到關注。TGFβ、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)為常用的肝纖維化相關因子。

1.1 結締組織生長因子(CTGF) CTGF是由TGFβ誘導產生的一種致纖維化蛋白，具有多種生物學活性，其作為TGFβ的下游反應元件主要參與調節細胞增生、分化及ECM的形成。CTGF異常高表達在肝纖維化病理過程中發揮重要作用，筆者的研究[5]證實其在非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠肝組織中表達顯著升高。此外，一項納入64例慢性丙型肝炎、22例丙型肝炎肝硬化患者的研究[6]發現，血清CTGF水平隨肝纖維化病理學分級進展而遞增，提示血清CTGF水平可反映肝纖維化進程。

1.2 白細胞介素(IL) IL參與肝星狀細胞增殖、集落因子的趨化等多個肝纖維化發生發展環節。已有研究[7]證實，IL-1、IL-6、IL-8具有促肝纖維化作用，IL-10具有抗肝纖維化作用。近年來，一些新的IL家族分子在肝纖維化中的作用被廣泛關注。日本Shoji等[8]研究報道197例經肝穿刺活組織檢查證實為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者的血清IL-34水平隨肝纖維化加重而逐漸增高，并進一步建立IL-34積分模型[IL-34-FS=(0.038 7×IL-34(pg/ml)+0.362 3×Ⅳ膠原7S(ng/ml)+0.018 4×年齡(歲)-1.185 0)]，經對比分析證實該模型診斷肝纖維化分級顯著優于其他模型，診斷F4期肝纖維化的特異度及敏感度均達80%以上，并可作為肝纖維化的獨立預測指標。

1.3 趨化因子 趨化因子在肝纖維化進展中發揮重要作用，其可能通過介導粒細胞、淋巴細胞聚集參與炎性反應，調節肝纖維化的進展。兩項獨立隊列研究[9]納入180例HCV感染者，觀察肝組織及血清CXCL9和CXCL10表達水平，結果顯示患者肝組織和血清CXCL9、CXCL10表達水平均顯著上調，且與肝纖維化分期呈正相關。Berres等[10]報道， 慢性HCV感染者血清CXCL10、CXCL11水平隨肝纖維化程度加重而逐漸升高。另有研究[11]發現，HBV和HCV相關重度肝纖維化患者血清CXCL12水平顯著增加，CXCL12對重度肝纖維化的診斷優于輕度肝纖維化。上述研究表明，CXCL9～12可作為肝纖維化進展的分子標志物。

1.4 高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73) GP73是一種新型高爾基蛋白。Wei等[12]在北京地壇醫院及解放軍三○二醫院進行了2項對照研究，其中761例HBV感染者行彈性成像檢測，633例HBV感染者行肝穿刺活組織檢查，對比分析患者血清GP73水平與肝纖維化程度的相關性。研究結果顯示血清GP73水平與肝臟硬度呈正相關(r=0.601)，診斷顯著肝纖維化(≥F2)的敏感度和特異度分別為62.81%和80.05%(臨界值為76.6 ng/ml)；與肝穿刺病理對比研究顯示，血清GP73水平與肝纖維化分期顯著相關，血清GP73濃度85 ng/ml可作為顯著肝纖維化的臨界值。此外，有研究[13]通過分析148例HBV感染者(輕度纖維化80例，顯著纖維化68例)血清GP73水平與肝組織學變化的關系，并與其他肝纖維化模型對比分析，亦證實顯著纖維化患者血清GP73水平與肝纖維化程度有較好的相關性，其敏感度為67.6%，特異度為80%，優于FibroTest、ALT與PLT比值指數(APRI)等評分；多因素logistic回歸分析顯示構建GP73、FibroTest、APRI聯合預測模型診斷率顯著提高。

1.5 血清細胞角蛋白片段(CK18-M30) CK18-M30是反映肝細胞凋亡的一種分子標志物。一項納入856例NAFLD患者的研究[14]結果顯示，血清CK-18能夠反映NAFLD患者脂肪變及肝纖維化程度，其敏感度和特異度分別為78%和87%。另一項納入3064例NAFLD患者的Meta分析[15]證實，血清CK-18水平診斷對非酒精性脂肪性肝炎相關F3～F4期肝纖維化具有較高的準確度[受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.85]，提示CK-18可作為肝纖維化的血清診斷分子標志物。

2 基質金屬蛋白酶(MMP)及其抑制物

研究[16]發現，肝細胞膜分泌的MMP和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)是ECM代謝過程中的關鍵酶，在肝纖維化形成和降解的動態平衡中發揮重要作用，可用于評估肝纖維化程度。血清TIMP-1預測早期肝硬化的敏感度達100%，特異度為56%～75%[17]。但近年來研究發現，MMP/TIMP比值能更準確反映肝纖維化程度。Lichtinghagen等[18]通過對比分析40例HCV感染者、20例HCV相關肝硬化患者及20例健康對照者血清MMP/TIMP比值，發現MMP-2/TIMP-1比值與肝組織炎癥及纖維化分級顯著相關。25例兒童膽道閉鎖分析顯示，血清MMP-7水平與肝組織MMP-7表達呈一致性上調[19]，提示MMP-7可作為診斷膽道閉鎖所致肝纖維化的生物學標志物。

3 ECM相關標志物

肝纖維化的本質為以膠原為主的ECM合成增多、降解減少，致使過多ECM沉積形成肝纖維化。ECM合成與降解相關細胞因子的表達及分泌可標志ECM沉積和肝纖維化的程度。

3.1 微纖維相關蛋白4(microfibrillar associated glycoprotein 4，MFAP-4) MFAP-4由肌成纖維細胞合成，作為細胞整合素配體參與細胞黏附和細胞間的相互作用，在ECM代謝過程中發揮重要作用。李森林等[20]分析了20例HBV相關肝纖維化患者血清MFAP-4水平及肝組織病理學變化，發現MFAP-4水平與肝臟炎癥活動度及纖維化程度呈正相關，提示血清MFAP-4可鑒別早期肝纖維化、進展期肝纖維化及肝硬化。為明確MFAP-4的肝臟特異性，M?lleken等[21]觀察了91例肺纖維化患者血清MFAP-4變化，證實肺纖維化患者血清MFAP-4與健康對照組無明顯差異，提示MFAP-4具有肝臟特異性，有望成為肝纖維化的血清學標志物。

3.2 人軟骨糖蛋白(YKL-40) YKL-40屬于甲殼質酶家族，是一種ECM相關蛋白，與ECM的重構和降解密切相關。研究[22]報道，酒精性肝纖維化及丙型肝炎肝纖維化患者血清YKL-40水平顯著升高。Rath等[23]對比分析55例慢性丙型肝炎患者血清YKL-40和瞬時彈性成像的診斷效果，結果顯示YKL-40診斷F≥2、F≥3及F=4肝纖維化的AUC分別為0.791、0.914及0.936，血清YKL-40診斷顯著肝纖維化(F≥3)的準確性明顯高于瞬時彈性成像，表明血清YKL-40具有良好的臨床診斷價值。Johansen等[24]觀察129例酒精性肝病患者血清YKL-40水平，證實YKL-40水平隨肝纖維化程度加重呈遞增趨勢，輕、中、重度肝纖維化均值依次為 270、466、676 μg/L，敏感度、特異度分別為51%和88%，提示YKL-40為鑒別肝纖維化分期具有良好特異性的血清分子標志物。

3.3 糖基化觸珠蛋白(fucosylated haptoglobin，Fuc-Hpt)和Mac-2結合蛋白(Mac-2 binding protein，Mac-2 bp) Fuc-Hpt和Mac-2 bp曾作為腫瘤標志物。近年研究發現二者與非酒精性脂肪性肝纖維化顯著相關。一項對126例經肝穿刺證實NAFLD患者的研究[25]顯示，血清Fuc-Hpt水平與肝組織NAS評分、肝纖維化分級顯著相關。Tawara等[26]分析了317例慢性丙型肝炎患者血清Fuc-Hpt、Mac-2 bp水平與肝纖維化的關系，結果顯示Fuc-Hpt、Mac-2 bp隨肝纖維化進展而呈遞增趨勢，多變量分析證實，Mac-2 bp與Fuc-Hpt可分別作為中度(F≥2)及重度(F≥3)肝纖維化的獨立預測因子及診斷標志物，聯合應用Mac-2 bp、Fuc-Hpt及FIB-4、可顯著提高診斷準確度。

4 非編碼RNA(ncRNA)

ncRNA是一類功能性RNA分子，其不編碼蛋白質，但能通過不同機制調控編碼蛋白基因的表達和功能，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝等重要的生物學過程，并且與疾病的發生發展、診斷和治療有著密切聯系。目前，關于ncRNA的相關研究主要針對microRNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)。

4.1 microRNA(miRNA) miRNA在正常機體循環中種類和豐度處于相對穩定的狀態，而肝臟代謝異常可破壞機體循環miRNA穩態，表現為疾病狀態下miRNA的差異表達。循環miRNA具有良好的穩定性和表達的特異性，現已成為疾病診斷和預后判斷的新型分子標志物。El-Ahwany等[27]檢測68例早期及65例顯著丙型肝炎肝纖維化患者血清miRNA表達水平，其中miR-138水平明顯增高，診斷早期肝纖維化的敏感度為89.3%，特異度為71.43%，診斷顯著肝纖維化的敏感度為89.3%，特異度為93.2%；miR-143診斷顯著肝纖維化的敏感度及特異度分別為75%及88.4%，表明miR-138可作為早期及顯著肝纖維化的診斷標志物，而miR-143可作為顯著肝纖維化的診斷標志物。Chen等[28]發現扶正化瘀治療的HBV患者血清內存在112個差異表達miRNA，進一步通過miRNA-Target Network評估扶正化瘀治療HBV療效，建立P=miRNAs診斷模型，發現miRNA診斷模型特異度及敏感度均高于Child-Pugh分級。

Cermelli等[29]對NAFLD患者及正常人的血清miRNA表達譜進行對比分析，患者血清miR-34a和miR-122表達水平明顯上調，且與ALT及AST水平、炎癥分級、肝纖維化分期呈正相關，提示miR-34a和miR-122可作為非酒精性脂肪性肝纖維化的診斷標志物。Roderburg等[30]對比分析肝硬化患者(67例)及健康人群(17例)血清miR-29a水平，結果顯示miR-29a血清水平隨Child-Pugh分級加重而逐漸降低，而與MELD評分呈相反趨勢。Ninomiya等[31]對比分析原發性膽汁性肝硬化(PBC)(10例)、慢性乙型肝炎(5例)、慢性丙型肝炎(5例)及健康志愿者(5例)血清miRNA表達譜變化，結果表明PBC患者血清中hsa-miR-503-3p、197-3p、500a-3p水平顯著低于健康對照組，hsa-miR-505-3p、139-5p和197-3p水平顯著低于病毒性肝炎肝纖維化患者。上述研究表明，血清miRNA可作為診斷不同病因肝纖維化的指標，并可能作為抗肝纖維化治療效果的潛在評估指標。

4.2 長鏈非編碼RNA(lncRNA) lncRNA是指長度超過200 bp的ncRNA，越來越多的研究顯示肝纖維化進展過程中多種lncRNA表達發生改變。張蕾等[32]比較PBC患者和健康人群外周血單個核細胞中lncRNA-AK053349表達，結果顯示PBC患者lncRNA-AK053349較健康對照組明顯增高，并與肝組織學分期、Mayo風險評分密切相關，表明lncRNA-AK053349可能為判斷PBC肝纖維化及肝損傷程度的潛在標志物。

本課題組采用高通量測序對比丙型肝炎肝纖維化患者與健康人群血漿lncRNA差異表達譜，發現474個表達上調、293個表達下調；進一步觀察輕度肝纖維化(F<2)、顯著肝纖維化(2≤F<4)、健康對照組血漿中lncRNA-ATB表達變化，結果顯示lncRNA-ATB水平與肝纖維化分期顯著相關[r=0.785，AUC為0.877]，敏感度、特異度分別為78.7%和88%，該指標有望作為肝纖維化的分子診斷標志物[33]。

ncRNA的研究已經取得很大進展，并發現了在肝纖維化中發揮重要作用的ncRNA，為肝纖維化的早期無創性診斷、鑒別、發病機制的研究及治療提供了新的思路。然而，對于外周循環中ncRNA分泌機制、動力學特點及清除機制目前尚未完全明確，因此其準確性及特異性有待進一步研究。

5 分子組學

近十年來，組學在生物醫學研究領域中發揮著越來越重要的作用。基因組學、蛋白質組學以及近年迅速發展起來的糖組學均可反映肝臟組織的整體性變化，通過分析比較，可得到肝纖維化階段差異表達的基因、蛋白質及糖類，進一步研究其功能作用，尋找特異性強的反映肝纖維化程度的血清學指標。

5.1 基因組學 基因組學已從基因序列研究轉移到基因功能研究，即為功能基因組學。單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism，SNP)可在多方面影響肝纖維化的發生及發展。加利福尼亞大學一項多中心隊列研究[34]納入916例慢性丙型肝炎患者進行SNP研究，結果發現1609個SNP位點與進展期肝纖維化相關，其中DEAD盒多肽5、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A與嚴重肝纖維化密切相關。肝纖維化相關因子的基因多態性可能影響肝纖維化的發生，多個SNP標志物聯合可預測慢性丙型肝炎肝硬化發生與進展的風險。

5.2 蛋白質組學 蛋白質組學在于大規模水平研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后修飾及蛋白間相互作用。Xu等[35]通過對126例慢性乙型肝炎患者血清二維凝膠電泳檢測發現轉鐵蛋白等3個小分子蛋白，其診斷中度肝纖維化(≥S2)的AUC為0.884～0.996，診斷顯著肝纖維化(≥S3)的AUC為0.785～0.875。Bell等[36]采用LC/MS-MS質譜法對比分析69例NAFLD患者和16例肥胖對照者血清蛋白，發現72個差異顯著的蛋白，其中27個蛋白任意2組差異>30%，15個蛋白的差異表達與F3/F4期肝纖維化程度相關。

5.3 糖組學 肝纖維化形成與ECM合成密切相關，ECM主要為膠原、糖蛋白和蛋白多糖， Callewaert等[37]應用糖組學技術診斷代償和失代償期肝硬化，應用基于DNA序列分析的臨床糖組學技術，檢測患者血清蛋白N-糖苷，可初步診斷肝纖維化，在代償性肝硬化患者中，其診斷敏感度和特異度分別為79%和86%，而在失代償期肝硬化患者中敏感度和特異度均為100%，表明通過檢測患者血清糖組學的差異變化，可區分不同程度肝纖維化。

5.4 代謝組學 代謝組學是繼基因組學、蛋白組學及糖組學之后的生物學新平臺，能夠定性和定量評估生物體受到異常刺激后代謝產物的動態變化。肝臟是人體最重要的代謝器官，糖類、脂類及氨基酸3大營養物質的代謝過程均在肝臟完成，因此，從代謝組學可對肝損傷程度、病變性質進行系統研究。日本學者Tokushige等[38]對NFALD和PBC患者進行LC/MS-MS質譜分析發現包括脫氫異雄酮、還原尿睪酮在內的28種代謝產物與肝纖維化相關。Embade等[39]應用核磁共振氫譜(1H-NMR)技術檢測丙型肝炎肝纖維化，發現膽堿、乙酰乙酸鹽、低密度脂蛋白為丙型肝炎肝纖維化患者差異最顯著的代謝物，提示1H-NMR技術可作為鑒別肝纖維化存在與否、嚴重程度的診斷方法。

組學可以在尚未出現肝纖維化之前區別出差異表達的基因、蛋白記憶不同的代謝水平，從而達到早期預測的目的。此外，組學可通過鑒定疾病進展中的基因/蛋白表達譜，預測疾病的轉歸及療效。

6 血清生物學指標的特點及存在的問題

血清新型分子標志物具有無創性、費用較低、利于動態監測等優點，對肝纖維化的診斷具有重要價值。目前，肝纖維化血清分子診斷標志物的應用尚缺乏統一標準，單一指標存在誤差，有時需多指標聯合診斷，以提高血清學標志物的臨床價值。

7 展望

肝纖維化是一個復雜的病理過程，其診斷需根據病原學、臨床、影像學、肝組織病理學及生化學等多方面聯合評估，新型血清分子診斷標志物的臨床應用將有助于肝纖維化病因分析、纖維化程度鑒別及預后判斷，為臨床治療策略的制訂及療效判斷提供科學依據。

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(本文編輯：葛 俊)

Novel molecular diagnostic markers for liver fibrosis

DUJinghua,NANYuemin.

(DepartmentofTraditionalandWesternMedicalHepatology,ThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

Liver fibrosis is an important pathological stage for the progression of chronic liver diseases to liver cirrhosis. Timely and accurate assessment of fibrosis degree plays an important role in guiding the treatment of chronic liver diseases. With the development of molecular biology techniques and wide application of molecular diagnostic techniques, the measurement of novel serum molecular diagnostic markers may contribute to the early diagnosis and precise treatment of liver fibrosis. A number of novel serum molecular markers with a diagnostic value have been identified, including fibroblast factor, matrix metalloproteinases and their inhibitors, extracellular matrix-related markers, and non-coding RNAs. In addition, genomics, proteomics, and metabolomics also have certain diagnostic values.

liver cirrhosis； biological markers； diagnosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.009

2016-12-05；

2016-12-05。

杜靜華(1985-)，女，醫師，博士，主要從事慢性肝病發病機制及防治策略的研究。

南月敏，電子信箱：nanyuemin@163.com。

R575.2

A

1001-5256(2017)03-0445-06