納豆激酶生產菌的紫外誘變選育

薛健　王歡

摘 要：本研究采用紫外線誘變育種的方法，篩選并選育納豆激酶高產菌株。試驗結果表明，使用20W紫外燈照射90s，經過篩選及纖維蛋白平板檢測，獲得了一株產酶活為498.84U/mL的高產菌株，產酶活力較出發菌株提高了6.78%。

關鍵詞：納豆激酶；物理誘變；紫外線

中圖分類號：S33 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131002

納豆是一種日本傳統食品，具有助消化、預防心血管疾病、延緩衰老等功效。1987年日本學者須見洋行首次對納豆及其提取物作了系統研究[1]。納豆激酶是在納豆發酵過程由納豆生產菌產生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[2]，具有很強的溶解纖維蛋白和血漿酶底物活性，它不但能作用于纖維蛋白，而且還能激活動物體內纖溶酶原，從而增加內源性纖溶酶的量與功能，表現出較強的溶血栓作用，可用于治療和預防血栓病 [3]。獲得納豆激酶的主要途徑是利用可以代謝產生納豆激酶的菌株發酵獲得，因而用于納豆激酶生產菌的產酶性能就顯得至關重要[4]。

納豆激酶生產菌屬細菌科，芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌的一個亞種[5]，常用的提高納豆激酶產量的途徑主要有3種：對野生菌種的誘變選育；優化納豆激酶生產菌的發酵條件；通過基因工程技術改造納豆激酶的相關基因[6]。本研究通過對納豆激酶生產菌菌株進行紫外線誘變處理，選育溶栓活力較高的納豆激酶生產菌，為今后的納豆激酶擴大化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆激酶生產菌（吉林農業科技學院生物工程學院實驗室保藏）。

1.2 試劑

瓊脂糖購自Spanish公司，纖維蛋白原，凝血酶及尿激酶購自Sigma公司，其他常規試劑為國產分析純。

1.3 培養基

肉湯液體培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa滅菌20min。

加倍肉湯液體培養基：牛肉膏1%，蛋白胨2%，氯化鈉1%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa滅菌20min。

纖維蛋白平板：纖維蛋白原20mg溶解于10mL PBS緩沖液中，50℃水浴待用。取凝血酶50μL（濃度為200μL/mL）的加入到10mL含2%瓊脂糖的PBS緩沖液中50℃水浴待用。將纖維蛋白原和含有凝血酶的溶液迅速混勻，倒入直徑6cm的平板內，放入4℃冰箱備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 紫外線物理誘變

挑取納豆激酶生產菌1環于盛有5mL肉湯的三角瓶中，置30℃過夜。

次日添加5mL新鮮的肉湯培養液，充分混勻后，繼續培養5h，分裝于2瓶三角瓶中。

任取1支5mL培養好的菌液倒入離心管中，1350轉/分離心10min。

棄去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，稀釋為細胞濃度為108個/mL的菌懸液。

20W紫外燈預熱30min后，取制備好的菌懸液3mL移入無菌培養皿內（含一無菌轉子），置于紫外燈下30cm處的磁力攪拌器上，開啟培養皿蓋后，在攪拌的條件下，紫外線照射分別為30s，60s，90s，120s和150s。

紫外線處理后的平皿中加入3mL加倍肉湯培養液，即用無菌遮光布包裹后放置于30℃恒溫培養箱內，避光培養24h。

計算致死率與正突變率，并使用纖維蛋白平板測定酶活力，并以相同的操作取未經誘變處理的菌液作為對照，選取產酶活最高的菌液轉接到發酵培養基中進一步搖瓶復篩，篩選出產酶較高的突變菌株。

1.4.2 致死率與正突變率的計算

紫外線物理誘變后菌株的致死率與正突變率計算公式[7]如下：

致死率（%）=[（未誘變平板菌落數-誘變后平板菌落數）/未誘變平板菌落數]×100

正突變率（%）=（酶活增加的菌株數/總菌株數）×100（正變株指酶活高于出發株的變異株）

1.4.3 納豆激酶酶活性檢測方法

在纖維蛋白平板上打直徑2mm的圓孔，吸取發酵液上清3μL點樣，靜置10min后放入37℃恒溫培養箱中，培養18h，測定透明圈的垂直直徑。根據尿激酶纖維蛋白溶解酶標準曲線，計算纖維蛋白溶解酶的酶活[8，9]。

2 結果與討論

2.1 紫外線誘變條件的確定

紫外線廣泛地被用作微生物誘變劑，它可使DNA分子形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對，并可能引起突變或死亡[10]。為研究紫外線照射時間對誘變效果的影響，本研究使用的紫外燈功率為20W，照射距離為30cm，照射時間分別為30s，60s，90s，120s和150s，紫外誘變時間與正突變率與致死率關系的曲線見圖1和圖2。結果表明起初正突變率隨著紫外誘變時間的增加而升高。當紫外線照射時間為90s時，正突變率為2.12%，此后，正突變率隨誘變時間增加而下降。隨著紫外線照射時間的延長，菌體細胞內的DNA分子所形成的嘧啶二聚體持續增加，從而影響菌體細胞分裂與增殖，導致致死率逐漸增加，當照射時間為90S時，致死率為79%。

2.2 紫外線誘變結果

通過對納豆激酶生產菌株進行紫外線誘變共篩選出3株產納豆激酶活力較高的突變株。紫外線誘變結果見表1。其中菌株2的納豆激酶活力最高，為498.84U/mL，菌株1和菌株3的產納豆激酶活力分別為495.36U/mL和486.23U/mL，均低于菌株2，而作為對照的納豆激酶生產菌出發菌株產酶活力為467.18U/mL。因此，本研究中經紫外線物理誘變得到產納豆激酶活力最高的正突變菌株為菌株2，其納豆激酶活力比原始菌株提高了6.78%。

本試驗研究了納豆激酶生產菌紫外線物理誘變的條件。確定了紫外線誘變條件為20W紫外燈照射距離30cm，照射時間90s，正突變率為2.12%，致死率79%，獲得了一株產酶活力為498.84U/mL正突變株，比原始菌株提高了6.78%。在本研究的基礎上，可以進一步進行復合誘變，并優化菌株的發酵條件，用于之后的納豆激酶擴大生產。

參考文獻

[1]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet [J].Experientia，1987，43（20）：1110-1111.

[2]楊艷燕，李順意，高尚，等.豆豉中納豆桿菌的篩選和納豆激酶的初步分離[J].沈陽藥科大學學報，2001，18（6）：436-438.

[3]劉柳，彭喜春.納豆激酶與豆豉纖溶酶酶學性質比較研究[J].中國釀造，2010，29（8）：88-90.

[4]夏麗，沙維，張麗萍.紫外線誘變選育高產納豆激酶菌株的研究[J].農產品加工（創新版），2010，206（4）：9-34.

[5]刁建中，陳桂光，馬波，等.納豆激酶的最新研究進展[J].輕工科技，2012（3）：7-8.

[6]陳志文，徐爾尼，肖美燕.納豆激酶的研究進展[J].山西食品工業，2002（1）：26-35.

[7]趙斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002：187-191.

[8]江曉，董明盛.一種食源性纖溶酶（納豆激酶）酶學性質研究[J].中國釀造，2002（1）：23-25.

[9]謝秋玲，郭勇.納豆激酶活性測定方法[J].廣東藥學，2000，10（6）：8-10.

[10]李榮杰.微生物誘變育種方法研究進展[J].河北農業科學，2009，13（10）：73-78.

作者簡介：薛健（1979-），男，講師，研究方向：代謝工程與發酵過程優化。