干細胞源性外泌體在心血管疾病中的研究進展

陳 嫚，許官學

·綜 述·

干細胞源性外泌體在心血管疾病中的研究進展

陳 嫚，許官學

外泌體；干細胞移植；心血管疾病；綜述

近年來，干細胞源性外泌體作為非細胞體系對心肌細胞的修復作用逐漸被大家認知。由于經皮冠狀動脈介入治療及外科旁路移植手術的發展，急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)患者的存活率顯著提高。然而，功能性心肌細胞丟失所致的心室重塑使幸存的AMI患者最終發展為心力衰竭(心衰)，遠期預后不容樂觀。剩余心臟組織有限的增殖及分化能力使得心臟結構再生面臨極大挑戰，心臟移植仍然是難治性心衰的最佳治療手段。研究者為改善AMI及缺血性心衰患者的預后做了諸多嘗試，其中干細胞移植被認為是治療心血管疾病最具前景的方法。目前已有大量基于動物模型的研究證實了多種干細胞移植的有效性，其中包括骨髓間充質干細胞、心臟干細胞(cardiac progenitor cells, CPC)、胚胎干細胞等[1-6]。新近研究發現，相比直接增殖分化為心臟譜系細胞，AMI后移植的干細胞通過旁分泌效應對梗死后心臟的保護作用更加明顯[7]。干細胞源性外泌體作為非細胞治療策略在心血管領域掀起了研究熱潮[8]，其對心血管疾病的發生、發展及對心臟的保護作用逐漸被人們認知，本文復習相關文獻綜述如下。

1 外泌體的生物學特征

1.1 概念與起源 外泌體是在研究正常細胞和腫瘤細胞脫落小體時首次提出，數年后Johnstone等[9]在研究網織紅細胞成熟過程中首次分離提純。隨著研究的深入，人們發現除了腫瘤細胞及網織紅細胞等細胞外，心臟譜系細胞如骨髓間充質干細胞、CPC、胚胎干細胞、內皮祖細胞及誘導多能干細胞等均可釋放外泌體。目前多認為外泌體來源于細胞膜向內出芽所形成的細胞核內體，細胞核內體進一步包裹胞漿內mRNA、miRNA、蛋白質諸如此類的遺傳物質，形成包含腔內小體的細胞核內體(多泡體)，多泡體與細胞膜融合并通過胞吐方式釋放至細胞外環境，最終形成外泌體[10]。

干細胞源性外泌體具有與其母體干細胞相似的生物功能，包含有大量與其功能相關的遺傳物質[11-12]。其中，miRNA是近年來受到廣泛關注的一種內源性高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，可在mRNA水平及蛋白翻譯過程中調節多種疾病的發生發展進程[13]。研究顯示，外泌體內miRNA的含量明顯高于在母體干細胞中的含量，且據母體干細胞特性，外泌體內會出現某種特定miRNA聚集現象[14]。外泌體作用于受體細胞后，可經向受體細胞或組織傳遞特異性遺傳物質，進而改變受體細胞或組織的生物學特征[15]。

1.2 生物學特征 外泌體是直徑介于30～100 nm的膜狀小體，并且外泌體質膜及其內部富含大量與其發揮生物學效應密切相關的蛋白質，目前研究較為明確的有：①轉膜蛋白和融合蛋白(Rab GTPases、flotillin、膜聯蛋白)；②細胞內源性蛋白(Alix、TSG101)；③整合素和4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)，熱休克蛋白(HSP70、HSP90)；④脂質相關蛋白和磷脂酶；⑤與外泌體母細胞性質密切相關的特異性蛋白[16]。

2 外泌體與干細胞旁分泌效應

干細胞移植被認為是治療心血管疾病最具前景的方法，既往研究認為干細胞主要通過直接分化為心肌細胞而發揮效應。然而van Berlo等[17]研究發現，小鼠體內心臟固有干細胞直接分化成新心肌細胞的比例為0.003%或更低，并對CPC的直接分化效應產生了質疑。此外，有實驗結果顯示，向大鼠梗死心肌內注射CPC培養液亦可減少心肌瘢痕組織，主要作用機制為外源性CPC通過旁分泌HGF、IGF-1、VEGF、β-FGF、SDF-1等細胞因子，以募集固有CPC并促進其遷移、生存、增殖、分化，發揮促進血管新生和抗凋亡的作用，從而改善心臟功能[18]。Lai等[19]通過分子體積、電鏡觀察、超速離心、質譜分析以及生化研究等方法，從干細胞培養液中提取出外泌體，并證實干細胞源性外泌體能夠有效減少小鼠AMI后的心肌梗死面積。新近研究發現，特異性去除CPC培養液中的外泌體可明顯減弱其對心臟的保護效應[20]。同樣的，去除外泌體可減少缺血預處理所調控缺血再灌注區的冠狀動脈灌流量[21]。這些研究均表明外泌體是干細胞旁分泌效應及缺血預處理心臟細胞的活性組分。目前，外泌體作為干細胞旁分泌效應的典型代表，在調控細胞信號傳遞、調節疾病生物學行為中的作用受到廣泛關注。

3 干細胞源性外泌體在心血管疾病中的研究

3.1 間充質干細胞源性外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes， MSC-exosomes) 大量臨床前研究已證實MSC-exosomes在治療心血管疾病中的效果。Arslan等[22]研究發現，人胚胎干細胞源性間充質干細胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells, ESC-MSCs)內包含有與外泌體高度吻合的直徑為50～100 nm的微小顆粒；向缺血再灌注小鼠模型輸入外泌體可明顯減少AMI面積；進一步將ESC-MSCs中提取的外泌體注入AMI小鼠模型中發現其心功能明顯改善。此外，有學者發現AMI后心臟組織中ATP及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平顯著升高，然而用外泌體處理后其活性氧水平降低；并進一步證明經外泌體處理后心臟組織中磷水解磷酸化AKT及糖原合成酶激酶-3顯著升高，而c-jun氨基末端激酶顯著降低[19]。Bian等[23]證明MSC-exosomes可明顯減少AMI兔模型心肌梗死面積，促進梗死周圍新生血管形成，改善心臟功能。Yu等[24]首先發現在MSCs中過表達鋅指轉錄因子-4(GATA1 binding factor-4， GATA-4)，然后再把提取的外泌體作用于AMI兔模型，發現MSC GATA-4-exosomes可明顯減少心肌梗死面積；并進一步發現MSC GATA-4-exosomes內富含大量miRs，特別是miR-19a，其含量比在MSC-exosomes中多；并證明miR-19a可下調磷酸酶及PTEN進而激活抗凋亡的AKT及細胞外信號調節激酶。Feng等[25]發現，缺血預處理小鼠MSC-exosomes內含有大量miR-22，當AMI時富含miR-22的外泌體可經下調甲基化CpG結合蛋白-2發揮抗心肌細胞凋亡作用。

3.2 心臟干細胞源性外泌體(cardiac progenitor cells derived exosomes， CPC-exosomes) Chen等[26]研究發現，小鼠CPC-exosomes可顯著抑制缺血再灌注損傷小鼠模型心肌細胞的凋亡。此外Barile等[27]證明，人CPC-exosomes可明顯抑制大鼠AMI后心肌細胞凋亡，促進梗死心肌周圍新生血管形成，改善AMI后心臟功能；進一步研究證明，CPC-exosomes內富含miR-210、miR-132及miR-146a-3p，其強大的抗心肌細胞凋亡和促血管生成效應，與高表達的miRNA激活下游靶蛋白ephrin A3、PTP1b及RasGaP-p120密切相關。Ibrahim等[28]在AMI小鼠模型的研究中也發現，CPC-exosomes可抑制心肌細胞凋亡，促進新生血管形成，改善心臟功能；并證明CPC-exosomes含有豐富的miR-146a，其主要通過miR-146a發揮心臟保護效應。此外，研究證明CPC-exosomes可改變成纖維細胞分泌活性，可使成纖維細胞分泌更多的基質細胞衍生因子-1及血管內皮生長因子，明顯改變成纖維細胞內miR的組分；向AMI大鼠模型心臟中移植CPC-exosomes預處理的成纖維細胞，可明顯改善其心臟泵血功能、增加血管生成密度及減少瘢痕組織面積[29]。新近研究發現缺氧可促進小鼠CPC-exosomes的釋放并改變其內遺傳物質的構成，缺氧的CPC-exosomes作用于缺血的心臟組織后可顯著降低組織生長因子、波形蛋白、I型及Ⅲ型膠原蛋白的表達；進一步研究發現缺氧的CPC-exosomes miR-17、miR-199a、miR-210及miR-292表達增高，并且這些miR可作用于涉及纖維化通路的靶基因發揮心功能保護作用[30]。Ong等[31]經基因芯片分析發現，過表達HIF-1的CPC所分泌的外泌體含有大量具有心臟保護作用的miR-126及miR-210，且通過向受體Sca1+CPC傳遞miR-126及miR-210，使Sca1+CPC內促存活激酶激活，進一步降低代謝能量需求，提高Sca1+CPC對缺氧的耐受能力，改善AMI后Sca1+CPC移植的效果。

3.3 胚胎干細胞源性外泌體(embryonic stem cells derived exosomes， ESC-exosomes)及誘導多能干細胞源性外泌體(induced pluripotent stem cells derived exosomes， iPS-exosomes) Arslan等[22]在ESC-exosomes的研究中發現，外泌體具有促進心臟增生反應的特異能力。ESC-exosomes富含脂質相關蛋白flotillin-1、多能性mRNA 轉錄本及miRNA-290；在氧化應激狀態下可通過向受體細胞傳遞外泌體內容物促進細胞增殖、存活及提高血管生成能力；AMI后心肌內注入ESC-exosomes可通過促進血管生成進一步增強心臟細胞增生能力，顯著改善心臟功能；進一步發現向AMI小鼠模型注入ESC-exosomes后可促進新生血管形成，提高心肌細胞存活率，減少心肌梗死面積；進一步證實ESC-exosomes可促進CPC存活及增殖，并發現ESC-exosomes含有大量miR-294、miR-294，可使CPC細胞周期向S期發展，說明ESC-exosomes主要通過向靶細胞傳遞miR-294等特異性miRs進一步發揮促細胞增殖及存活效應。

Wang等[32]證明，iPS-exosomes在缺血損傷狀態下可通過傳遞miR-21及miR-210促進心肌細胞存活，體外研究進一步發現，iPS-exosomes可通過抑制caspase 3/7的激活從而抑制過氧化氫誘導的氧化應激狀態下H9C2心肌細胞凋亡；此外，iPS-exosomes處理缺血再灌注損傷的大鼠心臟組織24 h后發現，TUNEL+/肌鈣蛋白I+的心肌細胞數量顯著下降。提示iPS-exosomes對缺血再灌注損傷狀態下心肌細胞具有保護效應。

4 展望

外泌體作為干細胞旁分泌效應的重要組成，可向靶細胞傳遞特異性miRNAs、mRNAs及蛋白，發揮促進細胞存活、增殖及血管生成效應。本文眾多文獻均證實了外泌體在心肌梗死后可對抗心肌缺血所致的心肌細胞凋亡及細胞增殖受限，并經促新生血管形成、抑制心臟纖維化等途徑改善心臟泵血功能。外泌體的這些特性使其有望成為AMI后心肌再生修復治療的新策略。盡管目前外泌體用于治療心血管疾病的臨床試驗還未進行，但其用于腫瘤患者的免疫療法已經開始I期臨床試驗，業已證明有良好的應用安全性[33-34]。相信不久的將來，干細胞源性外泌體治療心血管疾病的有效性及安全性將得到證實,為心血管疾病患者帶來福音。

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563003 貴州 遵義，遵義醫學院附屬醫院心血管內科

許官學，E-mail:xuguanxue2008@163.com

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A

1002-3429(2017)07-0107-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.07.033

2016-12-28 修回時間：2017-05-12)