白細胞介素-1β促進人真皮成纖維細胞分泌促血管生成及炎癥因子

潘毛毛，呂婷，張潔塵，聶舒，繆飛，王宏偉

復旦大學附屬華東醫院皮膚科，上海200040

白細胞介素-1β促進人真皮成纖維細胞分泌促血管生成及炎癥因子

潘毛毛，呂婷，張潔塵，聶舒，繆飛，王宏偉

復旦大學附屬華東醫院皮膚科，上海200040

目的探討IL-1對人真皮成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）的細胞抑制率、促血管生成因子和炎癥因子分泌的影響。方法CCK8法檢測不同濃度IL-1對HDF的細胞抑制率，ELISA法檢測3，10ng/m L IL-1處理HDF 24h后上清中血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子（FGF）、IL-6的表達。結果0.3、1、3、10ng/m L IL-1對HDF的抑制率分別為（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%。3、10ng/m L IL-1作用于HDF 24h后，兩組上清的VEGF、FGF水平較空白對照組均升高（FGF<0.05，VEGF<0.01），3，10ng/m l IL-1兩個濃度組間無統計學差異。3、10ng/m L IL-1兩組HDF上清中IL-6濃度較空白對照組均增加（<0.05，<0.001），且10ng/ m L IL-1組較3ng/m L組IL-6濃度更高，有統計學差異(<0.001)。結論IL-1可促進HDF分泌VEGF、FGF和IL-6，提示IL-1可能通過促進成纖維細胞分泌促血管生成和炎癥因子，進而促進腫瘤生成、浸潤和轉移。

人真皮成纖維細胞；白介素-1；成纖維細胞生長因子；血管內皮生長因子；白介素-6

成纖維細胞，作為合成、重塑細胞外基質的主要效應細胞，還通過分泌生長因子和機械收縮，支持血管生成和腫瘤細胞的侵襲和轉移[1]。白細胞介素-1 (interleukin1，IL-1)參與活化正常成纖維細胞，使其表達腫瘤間質成纖維細胞的特異性標志蛋白，促進腫瘤進展[2]。IL-1能促進內皮細胞和主動脈平滑肌細胞內皮血管生長因子(vascularendothelialgrow th factor，VEGF)及其受體的表達，在腫瘤介導的血管生成中發揮重要作用[3,4]。目前IL-1是否通過成纖維細胞分泌可溶性細胞因子，參與腫瘤血管生成和慢性炎癥反應尚不清楚，故本研究擬通過觀察IL-1對體外培養的人真皮成纖維細胞（human dermal fibroblast cell，HDF）分泌VEGF、FGF、IL-6的影響，初步探討IL-1對成纖維細胞分泌促血管生成因子及炎癥因子的影響，為進一步完善IL-1通過成纖維細胞促進腫瘤血管生成和進展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及來源HDF、成纖維細胞培養基FM購自ScienCell公司；DMEM高糖培養基購自HyClone公司；胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素購自Invitrogen-Gibco公司；人重組IL-1 10g購自PeproTech公司；human VEGF、IL-6ValukineELISA試劑盒購自R＆D公司；human FGFELISA試劑盒、CCK8試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HDF細胞培養HDF置于含2%FBS、1%FGS、1%青霉素-鏈霉素的成纖維細胞培養基中，37℃，5% CO2常規培養，待細胞長滿至80%左右胰酶消化2m in，800r/min，5min離心收集下層細胞，1∶2傳代培養。

1.2.2 CCK-8檢測IL-1對HDF細胞抑制率：HDF以6×104個/m L，100L/孔的密度鋪96孔板，37℃，5% CO2培養箱中預培養24h，加入10L不同濃度（0.3，1，3，10ng/m L）的IL-1與細胞共孵育24h，加入CCK8試劑10L/孔，孵育90m in酶標儀檢測450 nm處的OD值。細胞抑制率=（[對照組-實驗組）/（對照組-空白組）]×100%

1.2.3 HDF上清液的制備 無血清DMEM重懸混勻HDF細胞，細胞計數后按3×105個/m L，1m L/孔的密度鋪12孔板，37℃，5%CO2常規培養24h。第2天12孔板HDF細胞棄上清，PBS沖洗2次，添加（空白對照組不添加，低濃度LC組3ng/m L，高濃度HC組10ng/m L）人重組IL-1的無血清DMEM培養液各1m L，37℃，5%CO2作用24h。第3天收集上清，4℃，3 000g，15m in離心，小心吸取上層液體，行雙抗體夾心ELISA法檢測細胞因子。

1.2.4 細胞因子的測定采用ELISA試劑盒測定細胞上清中FGF、VEGF、IL-6水平，嚴格按說明書進行操作：準備洗滌劑、稀釋劑、標準品母液，加入標準品

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 5軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示，各組數據用單因素方差分析，<0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1 IL-1對HDF的形態改變和細胞抑制率200倍顯微鏡下觀察細胞形態，在0.3，1ng/m L IL-1刺激下，細胞形態與對照組無差異；在3，10ng/m L IL-1刺激下，HDF折光性增強，邊界銳化，細胞間連接增多，更向長梭形發展，未見凋亡細胞。0.3，1，3，10ng/ m L IL-1對HDF的抑制率分別為（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%，均不超過15%，見圖1。

圖1 不同濃度IL-1處理HDF24 h后的細胞形態和細胞抑制率

2.2 IL-1對HDF分泌促血管因子的影響低濃度LC組和高濃度HC組3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，兩組上清的FGF水平均升高，與空白對照組比較差異有統計學意義（=5.159，<0.05），低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統計學意義。LC組和HC組3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，兩組上清的VEGF水平均升高，與空白對照組比較差異有統計學意義（=16.23，<0.01），低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統計學意義，見圖2。

2.3 IL-1對HDF分泌IL-6的影響LC組和HC組3，10ng/m L的IL-1作用于HDF 24h后，上清中IL-6濃度與對照組相比均升高，差異有統計學意義（=50.59，LC組<0.05，HC組<0.001），高濃度的HC組與低濃度LC組相比HDF上清中IL-6升高，差異有統計學意義(<0.001)，見圖3。

圖2 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清HGF、VEGF濃度

3 討論

腫瘤間質成纖維細胞，通過直接接觸腫瘤細胞或者分泌可溶性成分，促進血管形成、腫瘤細胞存活和上皮-間質轉換(epithelia-mechenchymal transition, EMT)，從而導致腫瘤發生、侵襲和轉移，是一個極具吸引力的降低腫瘤耐藥和復發的治療靶點[5]。皮膚腫瘤間質成纖維細胞的原代培養存在標本難獲得、培養過程復雜、細胞不能穩定傳代等缺點，而腫瘤間質成纖維細胞是由正常成纖維細胞活化而來，因此我們選用HDF替代腫瘤間質成纖維細胞，初步探討IL-1對體外培養的HDF的作用。

圖3 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清IL-6濃度

Seok Lee等[6]研究發現IL-1能促進類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞增殖，且具有濃度依賴性。我們為了篩選適宜的IL-1作用濃度，檢測常用實驗濃度IL-1對HDF的細胞抑制率，發現3，10ng/m L的IL-1對HDF的細胞抑制率均不足15%，且形態學上激活成纖維細胞，所以后續實驗我們采用以上兩個濃度。與既往研究不同，本實驗未發現IL-1對HDF有促增殖作用，可能與選擇的成纖維細胞類型、具體濃度不同有關。

VEGF和FGF在臍靜脈內皮細胞和雞胚胎絨毛膜實驗的初試活化階段有協同作用，促進內皮細胞的增殖、遷移、分化和基質降解，是腫瘤血管生成關鍵的促血管生長因子[7]。KIM等[8]研究顯示1ng/m L的IL-1刺激內皮細胞和滑膜細胞24h后，上清中VEGF增加。我們研究發現3，10ng/m L的IL-1刺激HDF增強分泌VEGF、FGF，提示IL-1可以促進成纖維細胞參與血管生成和發展，與其他學者研究結果類似，推測在皮膚腫瘤中，IL-1誘導腫瘤微環境中各種成纖維細胞（包括肌成纖維細胞、腫瘤間質成纖維細胞等活化的成纖維細胞）分泌多種促血管生成因子，直接促進腫瘤血管生成，并參與構建促瘤的腫瘤微環境。

最新研究證實IL-6升高與口咽部鱗癌、食管鱗癌預后不良和早期復發高度相關，IL-6主要通過JAK/ STAT3通路介導EMT，也通過VEGF增強了血管和淋巴管生成，從而促進腫瘤的進展[9]。Paik等[10]研究顯示眼眶成纖維細胞在10ng/m L IL-1刺激24h后分泌的IL-6濃度增強13倍。諸多研究表明，IL-1誘導風濕性關節炎滑膜成纖維細胞合成IL-6[11]，本實驗我們也觀察到IL-1具有刺激HDF分泌IL-6的作用，而且高濃度組分泌水平高于低濃度組，可見IL-1促進HDF分泌IL-6可能存在濃度依賴性。本研究提示IL-1促進正常成纖維細胞成分泌大量IL-6，除了協同VEGF、FGF等參與腫瘤血管和淋巴管生成外，還可能通過IL-6誘導的EMT促進腫瘤轉移和侵襲。

[1]Coleman DT,Gray AL,StephensCA,.Repurposed drug screen identifiescardiac glycosidesas inhibitorsof TGF--induced cancer-associated fibroblast differentiation[J].Oncotarget, 2016,7(22):32200-32209.

[2]Chen H,YangWW,WenQT,.TGF-beta induces fibroblast activation protein expression;fibroblast activation protein expression increases theproliferation,adhesion,andm igration of HO-8910PM[corrected[J].Exp Mol Pathol,2009,87(3): 189-194.

[3]Voronov E,Carm iY,ApteRN.The role IL-1 in tumor-mediated angiogenesis[J].FrontPhysiol,2014,5:114.

[4]Marech I,LeporiniC,AmmendolaM,.Classicaland nonclassicalproangiogenic factorsasa targetof antiangiogenic therapy in tumormicroenvironment[J].Cancer Lett,2016,380 (1):216-226.

[5]Shiga K,Hara M,Nagasaki T,.Cancer-Associated fibroblasts:their characteristicsand their roles in tumor grow th [J].Cancers(Basel),2015,7(4):2443-2458.

[6]LeeWS,Lim JH,Sung MS,.Ethylacetate fraction from Angelica sinensis inhibits IL-1-induced rheumatoid synovial fibroblastproliferationand COX-2,PGE2,and MMPsproduction [J].BiolRes,2014,47:41.

[7]BaiY,Leng Y,Yin G,.Effectsof combinationsof BMP-2 w ith FGF-2 and/or VEGFon HUVECsangiogenesis in vitro and CAM angiogenesis in vivo[J].Cell Tissue Res,2014,356 (1):109-121.

[8]Kim KS,LeeYA,JiHI,.Increased expressionofendocan in arthritic synovial tissues:effects of adiponectin on the expressionofendocan in fibroblast-likesynoviocytes[J].MolMed Rep,2015,11(4):2695-2702.

[9]Culig Z.Interleukin-6asa therapy targetin oralsquamouscarcinoma[J].ExpertOpin Ther Targets,2013,17(1):53-59.

[10]Paik JS,ChoWK,Oh EH,.Palm itate induced secretion of IL-6 and MCP-1 in orbital fibroblasts derived from patients w ith thyroid-associated ophthalmopathy[J].Mol Vis,2012, 18:1467-1477.

[11]Singh AK,UmarS,RiegseckerS,.Regulationof transform ing grow th factor-Activated kinase activation by epigallocatechin-3-Gallate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts:suppression of K(63)-Linked autoubiquitination of tumor necrosis factorReceptor-Associated factor6[J].Arthritis&rheumatology, 2016,68(2):347-358.

IL-1 Promotes the Secretion of Angiogenic and Inflammatory Factors in Human Dermal Fibroblast

Pan Maomao,LüTing,Zhang Jiechen,Nie Shu,M iao Fei,Wang Hongwei*
Departmentof Dermatology,Huadong HospitalAffiliated to Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China

Objective Toexplore the roleof interleukin-1(IL-1)in inhibiting thegrow th ofhuman dermal fibroblast (HDF)and in promoting HDFsecretion ofangiogenic and inflammatory factors.Methods CCK8wasapplied in detecting the grow th inhibiting rateof HDF treatedw ith IL-1 of differentconcentrationswhile ELISA wasapplied in detecting theexpression levelsofvascularendothelialgrow th factor(VEGF),fibroblastgrow th factor(FGF)and IL-6 in HDF treatedw ith 3and 10ng/ m L IL-1 for 24 hours.Results The grow th inhibiting rate of HDF treated w ith 0.3ng/m L IL-1,1 ng/m L IL-1,3 ng/m L IL-1 and 10ng/m L IL-1 was(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%and(14.42±3.36)%respectively;theexpressions ofVEGFand FGFin3and 10ng/m l IL-1 group increased significantly andwerehigher than those inblank controlgroup(VEGF<0.01,FGF<0.05)while there existed no statisticaldifference in the expressionsbetween 3 and 10ng/m l IL-1 group;the expressions of IL-6 in 3 and 10ng/m l IL-1 group were higher than that in blank controlgroup<0.05,<0.001)while the expression of IL-6 in 10ng/m l IL-1 group wasmuch higher than that in 3ng/m l IL-1 group(<0.001).Conclusions IL-1 can promote HDFsecretion of VEGF,FGFand inflammatory cytokine IL-6,which indicates that IL-1 may promote the tumorigenesis,invasion andmetastasis..

human dermal fibroblast(HDF);interleukin-1(IL-1);fibroblastgrow th factor(FGF);vascular endothelialgrow th factor(VEGF);IL-6

2017-06-12）

（本文編輯：陳培蓮）

國家自然科學基金（81572671）

王宏偉，hongweiwang2005@aliyun.com

*Corresponding author:Wang Hongwei,E-mail:hongweiwang2005@aliyun.com