響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻培養(yǎng)基

謝麗丹，王素英

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300400)

響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻培養(yǎng)基

謝麗丹，王素英*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300400)

為了優(yōu)化螺旋藻培養(yǎng)基的基本配方，以純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉(NaNO3)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)為自變量，以螺旋藻藻藍蛋白含量為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken中心組合原理建立數(shù)學(xué)模型，進行響應(yīng)面分析(RSM)，確定螺旋藻培養(yǎng)基的最佳配方。結(jié)果表明，螺旋藻培養(yǎng)基最佳配方為純堿生產(chǎn)廢料17 g、硝酸鈉(NaNO3)2 g、氯化鉀(KCl)1 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.6 g，在此條件下，螺旋藻藻藍蛋白實際含量達到0.269 3 mg·L-1，與室外養(yǎng)殖采用的半合成培養(yǎng)基相比，藻藍蛋白含量提高了23%。

螺旋藻；響應(yīng)面；培養(yǎng)基優(yōu)化；藻藍蛋白

螺旋藻因富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、不飽和脂肪酸及微量元素，已被成功開發(fā)應(yīng)用并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但隨著螺旋藻應(yīng)用領(lǐng)域的擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量遠不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求[1]。本課題組在螺旋藻資源調(diào)查、多樣性分析的研究過程中發(fā)現(xiàn)，目前螺旋藻室內(nèi)培養(yǎng)主要采用合成培養(yǎng)基[2-4]，室外養(yǎng)殖主要采用添加天然堿的半合成培養(yǎng)基[5]。在實驗室條件下，單位時間內(nèi)螺旋藻在半合成培養(yǎng)基中生長獲得的生物量遠高于合成培養(yǎng)基，因此初步認(rèn)為半合成培養(yǎng)基更有利于螺旋藻的生長。

半合成培養(yǎng)基的主要成分是純堿生產(chǎn)廢料、磷酸鹽、氯化鉀和硝酸鈉，在不同的養(yǎng)殖場各成分的用量存在一定差異。本試驗以內(nèi)蒙古東勝螺旋藻養(yǎng)殖基地的經(jīng)驗配方為基礎(chǔ)，擬采用響應(yīng)面法對該配方主要成分的用量進行優(yōu)化，以達到提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻(內(nèi)蒙古東勝螺旋藻養(yǎng)殖基地) 由本實驗室保藏，編號NMZ1。純堿為生產(chǎn)廢料，丙酮為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，磷酸二氫鉀、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉為天津市贏達稀貴化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

MGC-250型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；JA4103A(0.01 g)型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DH-101-3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；PHSJ-5型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；U-5100分光光度計，日本 Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 螺旋藻培養(yǎng)

將螺旋藻NMZ1按照10%的接種量接種至250 mL的滅菌三角瓶中擴大培養(yǎng)，為后期試驗提供材料。培養(yǎng)條件：光照周期12 h/12 h，溫度32 ℃/28 ℃，pH為9.4，光照強度3 000 lx，每日早中晚各搖勻1次[6-7]。

1.3.2 螺旋藻藻藍蛋白的測定

取螺旋藻液30 mL離心，將藻絲懸浮在20 mL濃度為0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液中(pH值為7.8)，然后放在-20 ℃冰箱中冷凍，反復(fù)凍融3次后，用超聲波破碎儀破碎5 min，然后經(jīng)6 000 r·min-1離心20 min，用722分光光度計測其D652和D615值，再根據(jù)公式C/(mg·L-1)=(D615-0.208×D652)/5.34計算得出藻藍蛋白濃度[8-10]。

0.1 mol·L-1pH 7.8 磷酸緩沖液配置。甲溶液：磷酸氫二鈉35.9 g 溶解后稀釋至500 mL；乙溶液：磷酸二氫鈉2.76 g 溶解后稀釋至100 mL；甲91.5 mL，乙8.5 mL混合。

1.3.3 單因素試驗

培養(yǎng)基中含純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀，其基本用量為純堿生產(chǎn)廢料8 g、硝酸鈉1 g、氯化鉀0.5 g和磷酸二氫鉀0.5 g，依次改變其中一個組分的用量，其余3個組分的用量不變，配置半合成培養(yǎng)基。將對數(shù)期的螺旋藻接種到培養(yǎng)基中，將起始D560調(diào)至0.1，然后將其放入智能光照培養(yǎng)箱進行恒溫培養(yǎng)，測定螺旋藻藻藍蛋白的含量，進行單因素試驗，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取純堿生產(chǎn)廢料、磷酸二氫鉀、氯化鉀和硝酸鈉作為4個影響因素，采用Box-Behnken原理[11-14]，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，共進行29組試驗，中心試驗重復(fù)5 次，數(shù)據(jù)用Design Expert軟件分析確定培養(yǎng)基最佳配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 純堿生產(chǎn)廢料對螺旋藻生長的影響

保持其他條件不變，分別測定在純堿生產(chǎn)廢料為4、8、12、16、20 g時螺旋藻藻藍蛋白的含量，結(jié)果見圖1-A。由圖1-A可知，隨著純堿生產(chǎn)廢料的增多，螺旋藻藻藍蛋白的含量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，并在純堿生產(chǎn)廢料使用量為16 g時達到最高。

2.1.2 硝酸鈉對螺旋藻生長的影響

保持其他條件不變，分別測定在硝酸鈉為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g時螺旋藻藻藍蛋白的含量，結(jié)果見圖1-B。由圖1-B可知，螺旋藻藻藍蛋白的含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，以硝酸鈉使用量為2.0 g時最高。

2.1.3 氯化鉀對螺旋藻生長的影響

在其他條件不變的情況下，分別測定在氯化鉀為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g時螺旋藻藻藍蛋白的含量，結(jié)果見圖1-C。從圖1-C可以看出，螺旋藻藻藍蛋白的含量在氯化鉀添加量為1.0 g時達到最高。

2.1.4 磷酸二氫鉀對螺旋藻生長的影響

在其他條件不變的情況下，分別測定在磷酸二氫鉀為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g時螺旋藻藻藍蛋白的含量，結(jié)果見圖1-D。從圖1-D可以看出，隨著磷酸二氫鉀的增加，螺旋藻藻藍蛋白的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在磷酸二氫鉀為1.5 g時最高。

通過SPSS處理單因素實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀的含量變化都顯著影響螺旋藻藻藍蛋白的含量，結(jié)果如表1所示。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)響應(yīng)面法的設(shè)計原理，再結(jié)合單因素實驗的結(jié)果，確定了4個因素的水平取值，如表2所示。根據(jù)表2設(shè)定的水平和因素，以A(純堿生產(chǎn)廢料)、B(硝酸鈉)、C(氯化鉀)和D(磷酸二氫鉀)為自變量，螺旋藻藻藍蛋白含量(Y)為響應(yīng)值。

圖1 純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀對螺旋藻藻藍蛋白含量的影響Fig.1 Effect of soda ash production wastes， NaNO3， KCl and KH2PO4 on phycocyanin content of Spirulina

表1 單因素實驗的方差分析

Table 1 Analysis of variance for single factor

因素Factor離差平方和SumofSquaresofdeviations均方差meansquareerrorF值FvalueP值Pvalue顯著性Significance純堿生產(chǎn)廢料Sodaashproductionwastes80.0022062.7980**NaNO3277.76569.44152.7180**KCl67.52416.88113.1050.007**KH2PO4261.59665.39916.3660**

*表示在P<0.05水平時差異顯著；**表示在P<0.01水平時差異極顯著。下同。

*Means the difference is significant at the 0.05 level， ** means the difference is significant at the 0.01 level. The same as below.

表2 響應(yīng)面因素及水平

Table 2 Factors and levels in the response surface design

因素Factor水平Level-101A—純堿生產(chǎn)廢料Sodaashproductionwastes/g121620B—NaNO3/g1.52.02.5C—KCl/g0.51.01.5D—KH2PO4/g1.01.52.0

按表2實施29次試驗，并得到各個試驗條件的螺旋藻藻藍蛋白含量，結(jié)果如表3所示。由表3可知，螺旋藻藻藍蛋白最大值在實驗選取的中心點中(試驗號12)，因此優(yōu)化實驗不用進行最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

利用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進行擬合，得到回歸方程：

Y=0.27+0.045A-0.00233B+0.009C+0.0076×10-4D-0.0034AB+0.008AC+0.0065AD+0.019BC-0.002BD-0.0005CD-0.071A2-0.0036B2-0.043C2-0.042D2

在回歸方程中，A、C、D變量的正系數(shù)表明，該變量的正向變化能引起響應(yīng)值的增加，B變量的負系數(shù)表明，該變量的負向變化能引起響應(yīng)值的增加，負的二次項系數(shù)表明，方程的拋物面開口朝下，具有極大值點，可以進行最優(yōu)分析。

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表4。由表4可知，模型極顯著(P<0.000 1)，即方程在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。失擬項不顯著(P=0.051 9>0.05)，說明實驗誤差很小，模型與實驗擬合情況良好。模型的R2= 0.996 1，說明響應(yīng)值有99.61%來自所選自變量，只有0.39%的試驗不能用此方程確定，進一步說明此方程可用來進行螺旋藻藻藍蛋白含量的預(yù)測和分析。回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，方程的一次項A、C、D對螺旋藻藻藍蛋白的含量有極顯著的影響，B影響不顯著，從F值可以看出，單因素對螺旋藻藻藍蛋白含量影響的大小順序是：純堿生產(chǎn)廢料>氯化鉀>磷酸二氫鉀>硝酸鈉。方程的交互項AC、AD、BC及二次項A2、B2、C2、D2均對螺旋藻藻藍蛋白的含量有極顯著的影響，其余交互項的影響均不顯著，表明各因素對螺旋藻藻藍蛋白含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

試驗號TestnumberA純堿生產(chǎn)廢料SodaashproductionwastesB硝酸鈉NaNO3C氯化鉀KClD磷酸二氫鉀KH2PO4藻藍蛋白Phycocyanincontent/(mg·L-1)1-10010.111420-1-100.1995301-100.1562400-1-10.16635-100-10.1087610010.209170-1100.17818-1-1000.1091900000.26911011000.20481100-110.17691200000.2641130-10-10.17991401100.211515001-10.18751600000.264217-10-100.1052180-1010.20371910-100.17902000000.265221-10100.105422-11000.11932310100.211924100-10.180525010-10.1708261-1000.20812700110.19612800000.26442901010.1879

表4 回歸方程的方差分析

Table 4 Analysis variance of regression equation

來源source平方和Sumofsquares自由度df方差varianceF值FvalueP值Pvalue顯著性Significance模型0.071140.0051255.9<0.0001**A0.02410.0241196.07<0.0001**B6.487×10-516.487×10-53.260.0925C0.000910.000948.33<0.0001**D0.000710.000735<0.0001**AB4.556×10-514.556×10-52.290.1524AC0.000310.000313.440.0025**AD0.000210.00028.430.0116**BC0.001510.001573.94<0.0001**BD1.122×10-511.122×10-50.560.465CD1×10-611×10-60.050.8258A20.03210.0321625.12<0.0001**B20.008410.0084423.63<0.0001**C20.01210.012601.71<0.0001**D20.01210.012583.64<0.0001**殘差Residual0.0003141.99×10-5失擬項Lackoffit0.0003102.606×10-55.840.0519純誤差Pureerror1.786×10-544.465×10-6總和Overallerror0.07228

圖2 螺旋藻藻藍蛋白含量的預(yù)測值和真實值之間的程度擬合曲線Fig.2 The degree of fitting curve between predicted values and actual values for phycocyanin content

含量的預(yù)測值和真實值均接近于對角線，說明二者擬合程度好，模型的可靠性高。

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各個試驗因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面[15-17]。為了進一步分析純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀對響應(yīng)值的作用，固定其中兩個因素，使其處于中心水平，繪制另外兩個因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖，對各因素之間的交互作用進行可視化分析，圖3～圖5是對響應(yīng)值螺旋藻藻藍蛋白影響較大的兩因素交互作用的結(jié)果，其他因素交互作用不顯著。

響應(yīng)曲面的坡度變化及等高線的形狀及緊密程度可以反映因子之間的交互作用，響應(yīng)曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明培養(yǎng)基含量變化對螺旋藻藻藍蛋白的響應(yīng)靈敏程度[18-19]。等高線的形狀為橢圓形，表示兩個因素交互作用顯著，為圓形則表示兩個因素交互作用不顯著，等高線密度大小表示兩個因素交互作用強弱，密度大交互作用強，密度小交互作用弱[20]。圖3～圖5中等高線均呈橢圓狀，故兩因素交互作用顯著。由圖3可知，氯化鉀含量變化對螺旋藻藻藍蛋白的影響相對較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度較緩和等高線較稀疏，純堿生產(chǎn)廢料含量變化對螺旋藻藻藍蛋白影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度陡峭和等高線較密集；由圖4可知，純堿生產(chǎn)廢料含量變化對螺旋藻藻藍蛋白影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度較陡和等高線較密集，磷酸二氫鉀含量變化對螺旋藻藻藍蛋白影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度較緩和等高線較稀疏；從圖5可以看出，氯化鉀含量變化對螺旋藻藻藍蛋白影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面的坡度較陡和等高線較密集。

圖3 純堿生產(chǎn)廢料和氯化鉀對螺旋藻藻藍蛋白含量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for interaction of soda ash production wastes and KCl on phycocyanin content

圖4 純堿生產(chǎn)廢料和磷酸二氫鉀對螺旋藻藻藍蛋白含量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for interaction of soda ash production wastes and KH2PO4 on phycocyanin content

2.4 驗證試驗

通過回歸模型預(yù)測，給出的螺旋藻培養(yǎng)基最佳配方為純堿生產(chǎn)廢料17.32 g、硝酸鈉1.99 g、氯化鉀1.07 g、磷酸二氫鉀1.56 g，在此條件下螺旋藻藻藍蛋白的預(yù)測值為0.273 7 mg·L-1。考慮到實驗的可操作性，最佳配方修正為，純堿生產(chǎn)廢料17 g、硝酸鈉2 g、氯化鉀1 g、磷酸二氫鉀1.6 g，進行3次平行驗證實驗，螺旋藻藻藍蛋白實際含量為0.269 3 mg·L-1，與預(yù)測值相比無明顯差異，說明曲面響應(yīng)分析所得的模型是可靠的。

3 結(jié)論與討論

作為一種微生物，螺旋藻培養(yǎng)產(chǎn)率低、成本高、價格高，長期以來一直處于高端消費品行業(yè)，其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)是目前任何單一動物源、植物源及微生物源食物無法比擬的[14]。本試驗對內(nèi)蒙古東勝螺旋藻養(yǎng)殖基地的半合成培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高螺旋藻的產(chǎn)量和質(zhì)量。在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對螺旋藻培養(yǎng)基進行優(yōu)化，建立了純堿生產(chǎn)廢料、硝酸鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀含量變化對螺旋藻藻藍蛋白含量的二次回歸方程模型。通過回歸模型方差分析得知，純堿生產(chǎn)廢料、氯化鉀和磷酸二氫鉀含量變化對螺旋藻藻藍蛋白含量影響極顯著，硝酸鈉含量變化對螺旋藻藻藍蛋白含量影響不顯著。通過響應(yīng)曲面和等高線圖的直觀分析可知，純堿生產(chǎn)廢料和氯化鉀、純堿生產(chǎn)廢料和磷酸二氫鉀、氯化鉀和硝酸鈉的交互作用對響應(yīng)值影響最顯著，其他因素交互作用的影響不明顯。結(jié)合單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化模型確定螺旋藻培養(yǎng)基的最佳配方為：純堿生產(chǎn)廢料17 g、硝酸鈉2 g、氯化鉀1 g、磷酸二氫鉀1.6 g。目前，螺旋藻室外養(yǎng)殖半合成培養(yǎng)的各組分含量是純堿生產(chǎn)廢料8 g、硝酸鈉1 g、氯化鉀0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g，螺旋藻藻藍蛋白含量為0.219 1 mg·L-1，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后各組分含量均增加，螺旋藻含量達到0.269 3 mg·L-1，藻藍蛋白含量提高了23%。利用數(shù)理統(tǒng)計方法優(yōu)化螺旋藻培養(yǎng)基已有一些報道，田華等[21]采用正交試驗對合成培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，使螺旋藻的干質(zhì)量達到1.61 g·L-1，譙順彬等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻合成培養(yǎng)基，使螺旋藻干質(zhì)量達到1.82 g·L-1，本研究用優(yōu)化后的半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻，發(fā)現(xiàn)螺旋藻的干質(zhì)量達到了1.98 g·L-1，比報道的螺旋藻干質(zhì)量提高8.7%～22.9%。本試驗以內(nèi)蒙古東勝螺旋藻養(yǎng)殖基地的經(jīng)驗配方為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法對該配方主要成分的用量進行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量都有所提高。

圖5 氯化鉀和硝酸鈉對螺旋藻藻藍蛋白含量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for interaction of KCl and NaNO3 on phycocyanin content

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Optimization ofSpirulinamedia by response surface methodology

XIE Lidan， WANG Suying*

(TianjinKeyLaboratoryofFoodBiotechnology，CollegeofBiotechnologyandFoodScience，TianjinUniversityofCommerce，Tianjin300400，China)

To optimize the basic formula ofSpirulinamedium，the effects of soda ash production wastes， sodium nitrate(NaNO3)， potassium chloride (KCl)， potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) on the phycocyanin content ofSpirulinawere determined using the response surface methodology (RSM) . Results showed that the optimal formula ofSpirulinamedium was soda ash production wastes 17 g， NaNO32 g， KCl 1 g， KH2PO41.6 g， which can achieve 0.269 3 mg·L-1phycocyanin， 23% higher than that of the semi-synthetic medium used in outdoor cultivation.

Spirulina; response surface; medium optimization; phycocyanin

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.18

2016-09-09

國家自然科學(xué)基金項目(31270050)；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團隊(TD12-5049)

謝麗丹(1992—)，女，山西運城人，碩士，從事微生物資源前期開發(fā)研究。E-mail: 13820159533@163.com

*通信作者，王素英，E-mail: wsying@tjcu.edu.cn

Q179.1

A

1004-1524(2017)02-0307-08