A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC結構分析與生物學活性鑒定

許崇利，許崇波，宮語晨

(1.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林132022； 2.韶關學院 英東生命科學院，粵北生豬生產及疫病防控協同創新發展中心，廣東 韶關512005； 3.吉林農業大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118)

A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC結構分析與生物學活性鑒定

許崇利1，許崇波2，*，宮語晨3

(1.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林132022； 2.韶關學院 英東生命科學院，粵北生豬生產及疫病防控協同創新發展中心，廣東 韶關512005； 3.吉林農業大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118)

利用PCR擴增技術克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，構建含PLC1-250基因表達質粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重組菌株，序列分析和酶切鑒定證實構建的pN-PLC1-250重組質粒含有目的基因且基因序列與閱讀框架均正確。SDS-PAGE分析表明，PLC1-250蛋白表達量占菌體總蛋白相對含量的18.76%。利用SOPMA法預測PLC1-250蛋白分子的二級結構，且同源模建了其3D結構，結果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結構主要為α螺旋和無規則卷曲，三級結構與α毒素相類似。此外，還對其生物學活性進行了鑒定，可為進一步探索α毒素作用的分子機制，以及其分子結構與生物學功能的關系奠定基礎。

A型魏氏梭菌；α毒素PLC基因；生物學活性；圓二色光譜

A型魏氏梭菌(Clostridiumwelchiitype A)是引起人類食物中毒、氣性壞疽和腸毒血癥等腸道性疾病的主要病原菌，其分泌的α毒素由370個氨基酸組成，是A型魏氏梭菌主要的致病因子。α毒素具有溶血性、細胞毒性、皮膚壞死性和致死性等生物學特性[1-2]。研究表明，α毒素氨基端具有磷脂酶C(PLC)活性，可水解細胞膜的主要成分——磷脂酰膽堿。α毒素羧基端對于α毒素氨基端的生物學活性具有重要影響，其結構域對于α毒素結合細胞膜至關重要[3-4]。晶體結構分析表明，α毒素的酶活性部位包括催化位點和結合位點，其結構包括由9個α螺旋和1個活性位點組成的氨基端和由8個反平行的β折疊組成的羧基端[5]。α毒素的酶活性依賴于金屬離子Zn2+，主要結合位點是第56位的天冬氨酸，同時該位點也是其催化位點。Nagahama等[6]利用定點突變技術證實α毒素的某些氨基酸殘基會影響其生物學活性。Stevens等[7]和Nagahama等[8-9]構建了1～249氨基酸的α毒素氨基端，該片段保留了磷脂酶C活性。這些研究雖然證實α毒素氨基端具有磷脂酶C活性，但對于α毒素分子結構與生物學活性之間的關系并未進行深入的研究。本研究擬對α毒素氨基端PLC1-250基因進行表達，預測其蛋白二級結構，同源模建其3D結構，并測定PLC1-250蛋白的圓二色光譜，探索PLC1-250蛋白的生物學活性，以期為進一步研究α毒素分子結構與生物學功能的關系及其分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株

BL21(DE3)菌株和pET-32a購自Novagen公司；重組菌株BL21(DE3)(pXETA02)由韶關學院許崇波教授惠贈；活性檢測用的小鼠購自吉林大學實驗動物中心。

1.2 試劑

QDL2000 DNA分子量標記、ExTaq酶、T4DNA連接酶、限制性核酸內切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ)和IPTG購自寶生物工程有限公司；氨芐西林(Amp)和卡那霉素購自Sigma公司；Wizard PCR preps DNA Purification System購自Promega公司。

1.3 表達質粒pN-PLC1-250的構建

根據Titball等[10]報道的PLC1-250基因序列設計PCR擴增引物并合成，引物序列為：上游引物P1，5′-CATGCCATGGCATGGGATGGAAAGATTGAT-3′，下游引物P2，5′-CCGGAATTCTGATGGATCATTACCCTC-3′。上游引物和下游引物分別含EcoRⅠ和NcoⅠ的酶切位點及保護性堿基。利用這對PCR引物從重組質粒pXETA02擴增出α毒素氨基端PLC1-250基因片段。參照文獻[11]的方法，NcoⅠ和EcoRⅠ分別酶切PCR產物和pET-32a載體，16 ℃ T4DNA連接酶連接過夜。隨后將連接產物轉化至感受態細胞BL21(DE3)中，利用Amp抗性篩選出陽性克隆，提取重組表達質粒pN-PLC1-250，并進行酶切鑒定和測序。

1.4 pN-PLC1-250表達及SDS-PAGE分析

按文獻[11]報道的方法進行。

1.5 α毒素和PLC1-250蛋白二級結構預測

按Geourjon等[12]介紹的方法，在EXPASY服務器(http://www. expasy. org/ tools)上利用SOPMA法預測α毒素和PLC1-250蛋白二級結構。

1.6 α毒素和PLC1-250蛋白3D結構預測

以蛋白質結構數據庫(PDB)提供的α毒素三維結晶結構(3D)為模板，使用EXPASY服務器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)對α毒素和PLC1-250蛋白3D結構進行同源模型構建，并用Rasmol軟件繪制其3D結構圖[13]。

1.7 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圓二色譜分析

使用J810-150S型圓二色譜儀測定α毒素和PLC1-250蛋白的CD光譜，并記錄數據[14]。

1.8 PLC1-250蛋白生物學活性測定

將A型魏氏梭菌標準株C57-1的培養上清液和重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的菌體、菌體裂解物和上清液分別接種于卵黃瓊脂平板和血瓊脂平板，觀察是否具有磷脂酶C活性和溶血活性[15]。將100 μL含卵磷脂的卵黃稀釋液分別加入3只Eppendorf管，再分別加入100 μL生理鹽水、PLC1-250蛋白和α毒素進行混勻，37 ℃恒溫孵育24 h，通過觀察渾濁環出現與否來檢測是否具有磷脂酶C活性[16]。另取80只小鼠分為4組，每組20只，將A型魏氏梭菌標準株C57-1和5×109個重組菌株BL21(DE3) (pN -PLC1-250)經口服或腹腔注射到小鼠體內，觀察臨床癥狀并進行病理檢測[17]。

2 結果與分析

2.1 pN-PLC1-250重組表達質粒的構建與鑒定

利用PCR擴增技術，以pXETA02質粒為模板，擴增出α毒素氨基端0.75 kb的PLC1-250基因，NcoⅠ和EcoRⅠ分別酶切PCR產物和pET-32a載體，連接后轉化至BL21(DE3)中，構建含PLC1-250基因表達質粒的重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)，提取重組質粒pN-PLC1-250，并用限制性核酸內切酶NcoⅠ/EcoRⅠ進行酶切鑒定，結果證實重組質粒pN-PLC1-250含有PLC1-250基因，核苷酸序列分析表明其基因序列和閱讀框架均正確(圖1)。

2.2PLC1-250基因表達產物的SDS-PAGE分析

重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)IPTG誘導4 h后取樣，進行SDS-PAGE分析。結果表明，PLC1-250基因在BL21(DE3)宿主菌中得以表達，經凝膠成像儀掃描分析，PLC1-250蛋白表達量占菌體總蛋白相對含量的18.76%(圖2)。

2.3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結構預測

應用EXPASY服務器(http://www. expasy.org/ tools)上的SOPMA法預測α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結構(圖3)。α毒素蛋白中：α螺旋118個，占31.9%；β折疊78個，占21.1%；β轉角44個，占11.9%；無規則卷曲130個，占35.1%。PLC1-250蛋白中：α螺旋97個，占38.8%；β折疊42個，占16.8%；β轉角36個，占14.4%；無規則卷曲75個，占30.0%。預測結果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結構與α毒素氨基端部分的二級結構相比發生了一些變化，其二級結構主要為α螺旋和無規則卷曲，二者共占68.8%。

M，DL2000 DNA分子量標準；1，pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠM， DL2000 DNA marker; 1， pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠ圖1 重組質粒pN-PLC1-250酶切鑒定結果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pN-PLC1-250 by enzyme digestion

M，低分子量蛋白標記；1，BL21(DE3)(pET-32a)全菌體；2，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)全菌體；3，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)包涵體M， Low molecular protein marker; 1， Total cell lysate of BL21(DE3)(pET-32a); 2， Total cell lysate of BL21(DE3)(pN-PLC1-250); 3， The inclusion bodies of BL21(DE3)(pN-PLC1-250)圖2 PLC1-250基因表達產物SDS-PAGE結果Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant strain BL21(DE3)(pN-PLC1-250)

2.4 α毒素和PLC1-250蛋白分子的3D結構預測

以蛋白質結構數據庫(PDB)提供的α毒素的三維結晶結構(3D)作為模板，利用EXPASY服務器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)對α毒素和PLC1-250蛋白3D結構進行同源模型構建，并用Rasmol軟件繪制其3D結構圖。結果顯示，α毒素蛋白共有9段α螺旋和8段β折疊，PLC1-250蛋白3D結構也包括9段α螺旋，與α毒素蛋白氨基端部分的3D結構相類似(圖4)。

2.5 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圓二色譜分析

借助圓二色譜儀測定α毒素和PLC1-250蛋白分子的CD光譜(圖5、表1)，結果顯示，二者的CD光譜相類似。

h，α螺旋； e，β折疊； t，β轉角； c，無規則卷曲h， alpha helix; e， beta extended strand; t， beta turn; c， random coil圖3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結構預測及比較Fig.3 Prediction and comparison of the second structure of α-toxin and PLC1-250 protein

2.6 重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)生物學活性測定

A型魏氏梭菌標準株C57-1培養上清液和重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養上清液及菌體培養物在卵黃瓊脂平板上均出現了特征性渾濁環，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌體裂解物并沒有出現特征性渾濁環，這說明PLC1-250是以分泌形式表達的，并且能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂。磷脂酶C活性檢測結果顯示(圖6)：出現渾濁環的1號和2號管均能分解卵黃中的卵磷脂。上述結果表明，PLC1-250蛋白與α毒素一樣具有磷脂酶C活性。

在血瓊脂平板上，A型魏氏梭菌標準株C57-1培養上清出現了溶血環，而重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養上清液、菌體培養物及菌體裂解物均沒出現溶血環，表明PLC1-250表達產物不具備α毒素的溶血活性。口服和腹腔注射重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的小鼠(試驗組)，觀察3周后沒有出現臨床癥狀，且剖檢后組織學檢查顯示，無病理變化(圖7)，表明重組菌株BL21(DE3) (pN-PLC1-250)已經沒有致病性，而對照組(A型魏氏梭菌標準株C57-1)則出現明顯的臨床癥狀，且剖檢后組織學檢查顯示，發生病理變化(圖8)。

圖4 α 毒素(A)和PLC1-250蛋白(B)分子3D結構預測Fig.4 Prediction of the three-dimensional structure (3D) of α-toxin (A) and PLC1-250 protein(B)

圖5 α毒素(A)和PLC1-250蛋白分子(B)的圓二色譜圖Fig.5 Circular dichroism (CD) spectrum of α-toxin (A) and PLC1-250 protein (B)

表1 圓二色譜測定的α毒素和PLC1-250蛋白分子二級結構成分比較

Table 1 Comparison of secondary structure elements of α-toxin and PLC1-250 protein based on circular dichroism spectrum

成分Elementα毒素α-toxin氨基配數量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α毒素氨基端PLC1-250蛋白PLC1-250ofα-toxinamino-termi-nal氨基配數量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α-螺旋Alphahelix12032.59839.2β-折疊Betaextendedstrand7620.53815.2β-轉角Betaturn4311.63815.2隨機卷曲Randomcoil13135.47630.4

1， α毒素； 2， PLC1-250蛋白； 3， 生理鹽水1， α-toxin; 2， PLC1-250 protein; 3， Physiological saline water圖6 α毒素和PLC1-250蛋白的磷脂酶C活性檢測Fig.6 Detection of phosphalipase C activity of α-toxin and PLC1-250

3 小結

本研究利用PCR擴增技術克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，構建起含PLC1-250基因表達質粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重組菌株，經序列分析和酶切鑒定，證實所構建的pN-PLC1-250重組質粒含有目的基因，且基因序列與閱讀框架均正確。利用SOPMA法預測PLC1-250蛋白分子的二級結構，同源模建其3D結構，結果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結構主要為α螺旋和無規則卷曲，三級結構與α毒素相類似。對PLC1-250蛋白的生物學活性進行鑒定，結果顯示，重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養上清液及菌體培養物在卵黃瓊脂平板上均出現了特征性渾濁環，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌體裂解物并沒有出現特征性渾濁環，這說明PLC1-250是以分泌形式表達的，并且能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂，即PLC1-250蛋白與α毒素一樣具有磷脂酶C活性。小鼠試驗結果表明，PLC1-250蛋白沒有溶血活性及致病性。這些工作為今后深入探索α毒素作用的分子機制，以及其分子結構與生物學功能的關系奠定了基礎。

A， 空腸； B， 肝臟； C， 肺臟； D， 心臟。圖8同A， Jejunum; B， Liver; C， Lung; D， Heart. The same as in Fig. 8圖7 試驗組小鼠組織學檢查結果Fig.7 Histological examination results of mice in the experimental group

圖8 對照組小鼠組織學檢查結果Fig.8 Histological examination results of mice in the control group

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(責任編輯 高 峻)

Structural analysis and identification of biological activity of alpha-toxin amino-terminal PLC fromClostridiumwelchiitype A

XU Chongli1， XU Chongbo2，*， GONG Yuchen3

(1.CollegeofBiologyandFoodEngineering，JilinInstituteofChemicalTechnology，Jilin132022，China; 2.NorthGuangdongCollaborativeInnovationandDevelopmentCenterforSwineFarmingandDiseaseControl，YingdongCollegeofLifeSciences，ShaoguanUniversity，Shaoguan512005，China; 3.CollegeofAnimalScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Amino-terminalPLC1-250 gene ofClostridiumwelchiiα-toxin was amplified by PCR. The recombinant strain BL21 (DE3)(pN-PLC1-250) containingPLC1-250 gene was constructed. It was shown that the recombinant plasmid pN-PLC1-250 containedPLC1-250 gene with correct sequence and ORF by identification of endonuclease-digesting and sequence analysis. SDS-PAGE analysis showed that the expression level of PLC1-250 proteins were about 18.76% of total cellular proteins. The secondary structure and three-dimensional structure of PLC1-250 proteins were predicted by SOPMA method on EXPASY website. The results showed that the secondary structure of PLC1-250 protein was composed of alpha helices and random coils. The three-dimensional structure of PLC1-250 protein was similar with amino-terminal domain of α-toxin protein. The study of biological activity laid foundation for further research of the molecular mechanism of α-toxin and the relation of its molecular structure and biological function.

Clostridiumwelchiitype A; alpha-toxinPLC-gene; biological activity; circular dichroism spectra

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.06

2016-09-26

吉林省教育廳“十三五”科學研究規劃項目(2016138)

許崇利(1974—)，男，黑龍江雞東人，博士，教授，研究方向為微生物分子生物學。E-mail: xcl902@163.com

*通信作者，許崇波，E-mail: xcb902@163.com

S852；Q78

A

1004-1524(2017)02-0213-07