五苓散對實驗性銅中毒大鼠的治療作用

程 顏，劉亞云，張方潔，黃翠華，康佑汐，韓春楊，陳玎玎，劉翠艷，*

(1. 安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽農業大學 生物技術中心，安徽 合肥 230036)

五苓散對實驗性銅中毒大鼠的治療作用

程 顏1，劉亞云1，張方潔1，黃翠華1，康佑汐1，韓春楊1，陳玎玎2，*，劉翠艷1，*

(1. 安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽農業大學 生物技術中心，安徽 合肥 230036)

為探討中藥利濕方劑五苓散對動物體內銅排泄的影響，通過飼喂高銅飼料建立SD大鼠亞慢性銅中毒病理模型，然后用五苓散進行治療。分別在造模成功和治療結束時進行心臟采血，火焰原子吸收法測定大鼠血液銅含量，試劑盒法測定血清中AST、LDH和SOD的活性；試驗結束時剖殺大鼠，觀察內臟器官的病理變化，并取肝臟、腎臟進行組織病理學檢查。造模結束時檢查發現，與對照組相比，模型組大鼠體質量增長速度減緩，肝臟和腎臟出現明顯的病理學變化，血液銅含量極顯著升高(P<0.01)，說明造模成功。采用五苓散治療后，與模型組比較，治療組大鼠肝腎病理學變化明顯減輕，血液中銅含量顯著降低(P<0.05)；SOD活性升高(P<0.05)，AST和LDH活性降低(P<0.05)；與空白對照組比較，治療組大鼠上述指標均無顯著差異(P>0.05)。上述結果表明，五苓散能有效促進銅中毒大鼠體內銅的排泄，減輕肝、腎組織損傷，可用于臨床動物亞慢性銅中毒的治療。

五苓散；大鼠；銅中毒；治療

銅是動物機體必需的微量元素之一，其最重要的生理作用是作為金屬酶的組成部分參與體內代謝，在保證動物健康生長和提高生產力方面起著不可替代的作用。自1955年Barber等[1]提出“在生長肥育豬的日糧中添加高于正常生理需要數10倍量的銅可促進生長及改進飼料利用率”后，銅開始作為一種畜禽促生長劑被廣泛使用，而且其使用劑量往往超出畜禽本身最大耐受量。不可忽視的是，銅還是一種有毒元素，美國EPA(美國環境保護署)將銅列為第4類優先考慮的毒性元素。長期使用高銅飼料，除了可能引起動物銅中毒外，還會因高銅降低鋅和鐵的吸收，從而引起鋅和鐵的缺乏，導致動物肝、腎中銅殘留量顯著增加，從而影響動物性食品安全，危害人類健康。因此，除了制定法令法規限制銅在飼料中的使用外，促進動物體排銅也是一個重要方面。

目前，對于食用動物慢性銅中毒基本不治療，國外有報道稱醋酸鋅是一種有效、無毒的治療犬銅中毒的藥物[2]。在人醫臨床上，銅中毒病人的搶救除支持療法和對癥治療外，主要用二巰基丙磺酸鈉和青霉胺進行治療或采用白蛋白透析[3]，但這些方法目前在獸醫臨床上尚未采用。另外，西藥治療多為對癥治療，需要不同藥物的相互作用，從而增加機體代謝負擔；有時還導致機體對其他元素的攝入量增加，而銅中毒時機體本身對這些元素的代謝是降低的，從而導致其他疾病發生的概率增大[4]。中藥源于天然，毒副作用小，不易產生耐藥性；而且中藥治病不僅僅是治療某一種病癥，更重視機體內環境的調節，因而更適合人和動物疾病的治療。中藥方劑五苓散具有溫陽化氣、利濕行水的功效，與銅中毒證治相合，可用于銅中毒的治療，但目前有關中藥排泄重金屬的研究和應用還不夠廣泛和深入，因此本研究嘗試采用利濕方劑五苓散對大鼠實驗性銅中毒進行治療，以期為醫學尤其是獸醫學臨床應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠30只，雄性，5周齡，體質量(100 ± 5)g，購自江蘇愛爾麥特科技有限公司，動物許可證號為SCXK(蘇)2014-0007。

1.2 主要試劑與儀器

谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒：均購自南京建成生物工程研究所；銅標準貯備液(1 000 mg·L-1)：購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、高氯酸為優級純；實驗用水為電阻值18.2 MΩ的超純水。

BSA124S-CW型電子分析天平，由北京賽多利斯有限公司生產；CelercareV1型全自動生化分析儀，由天津微納芯科技有限公司生產；RE52CS旋轉蒸發儀，由上海亞榮生化儀器廠生產；BA200型數碼顯微鏡，由廈門麥克奧迪實業集團有限公司生產；石蠟切片機，由德國Sigma公司生產；ZEEnit700P原子吸收光譜儀，由德國耶拿公司生產。

采樣瓶與分析器具處理：采集水樣的聚乙烯塑料瓶及實驗用的玻璃器皿必須用洗滌劑洗凈后，在硝酸溶液中浸泡，反復沖洗，使用前用去離子水潤洗1～2次。

1.3 SD大鼠慢性銅中毒模型的建立及五苓散治療試驗

1.3.1 五苓散水煎液的制備

取干燥的五苓散飲片128 g(豬苓、澤瀉、白術、茯苓、桂枝的質量比為3∶5∶3∶3∶2)，制成粗粉；加8倍量去離子水浸泡40 min；武火煮沸后，改用文火，保持微沸40 min；紗布過濾；藥渣再加5倍量溫水煎煮，小火保持微沸30 min，過濾；合并2次煎液，958g離心15 min，旋轉蒸發儀濃縮至256 mL(相當于含生藥0.5 g·mL-1)，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存備用。

1.3.2 處理設計

將30只大鼠隨機分成3組，即對照組、模型組和五苓散治療組，每組10只。對照組飼喂普通飼料，模型組和五苓散治療組飼喂高銅飼料(Cu含量700 mg·kg-1)，連續飼喂28 d，期間自由飲水。每天記錄各組大鼠的精神狀況、形態體征、采食飲水情況等，每周稱量體質量1次。造模成功后，治療組按每kg體質量3.125 g的劑量(此為前期摸索出的最佳劑量)給大鼠灌胃五苓散煎液，對照組和模型組給予等量去離子水，每天2次，連續10 d。

1.3.3 樣品采集

大鼠于最后1次給藥后禁食12 h，不禁水。實驗時先稱量，再以乙醚吸入麻醉，心臟采血，收集3 mL抗凝血，2 mL非抗凝血；然后頸椎脫臼處死大鼠，進行病理剖檢，觀察內臟器官的變化，并取肝、腎等組織，以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定。

1.3.4 火焰原子吸收分光光度法檢測大鼠全血銅含量

(1)血樣前處理。準確吸取2 mL待檢全血于50 mL燒杯中，加入8 mL硝酸和2 mL高氯酸，充分混勻，加蓋表面皿，置于60 ℃烘箱內過夜。次日于電熱板上加熱消解，直至清亮透明冒白煙，再進一步消煮至盡干。取下燒杯，冷卻，用超純水定容至10 mL，待測。同時進行空白樣品的處理。

(2)銅標準工作液的配制。吸取銅標準貯備液1 mL，用0.5%的硝酸定容至100 mL，制得濃度為10 mg·L-1的銅標準中間液。再從中分別吸取1、3、5、7、9 mL，定容至100 mL，即獲得0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg·L-1的系列標準工作液。

(3)原子吸收光譜儀的工作條件。分析波長：24.8 nm；燈電流：3 mA；狹縫寬度：1.2 nm；原子化方式：火焰；火焰類型：C2H2/Air；火焰高度：6 nm。

1.3.5 大鼠血清SOD、AST、LDH活力測定

將全血樣品958g離心20 min，分離血清。按試劑盒說明書，用全自動生化分析儀進行血清樣品中SOD、AST、LDH的活性測定。每個樣品3個重復。

1.3.6 肝、腎組織的病理學觀察

將固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中的肝臟、腎臟等組織，進行石蠟切片，HE常規染色，顯微鏡觀察其組織學變化。

1.4 數據處理

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 19. 0 軟件包中多因素方差分析及Duncan法進行統計檢驗。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀觀察及體質量變化

隨著高銅飼料喂飼時間的延長，模型組大鼠表現為形體消瘦、被毛焦燥、顏色發黃。在體質量方面，對照組和模型組大鼠初質量均為(100 ± 5) g，第1周稱量兩組體質量差異不明顯(P>0.05)，第2周至第4周稱量兩組體質量差異顯著(P<0.05)，模型組大鼠體質量增長速度較正常對照組明顯減慢(表1)。

2.2 病理剖檢

模型組大鼠：肝均質脆，發黃，腫脹明顯；腎臟腫脹，呈巧克力色；肺部有充血；腸道中的糞便稀薄發綠。

治療組大鼠：肝臟略黃，腫脹不明顯；腎臟稍軟，略腫或不腫；肺和腸道未見明顯異常。

表1 大鼠喂高銅飼料期間體質量變化

Table 1 The changes of body weight of rats in two groups after treated with different level of Cu g

同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as bellow.

2.3 血液中銅含量測定

2.3.1 造模結束時對照組、模型組大鼠血液中銅含量的變化

造模結束時，模型組大鼠血液銅含量為(1.058±0.019) μg·g-1，顯著高于對照組大鼠血液銅含量(0.793±0.112)μg·g-1(P<0.01)，說明造模成功。

2.3.2 五苓散治療后各組大鼠血液中銅含量的變化

由表2可知，用五苓散治療后，治療組大鼠血液中銅含量顯著低于模型組(P<0.05)，而與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，說明五苓散對大鼠體內銅排泄有顯著作用。另外，模型組大鼠血液中銅含量在試驗結束時也比造模結束時有所降低，是大鼠正常代謝的結果。

表2 五苓散治療后各組大鼠血液中銅含量的變化

Table 2 The changes of Cu content in blood of rats in three groups after treatment μg·g-1

2.4 五苓散治療后各組大鼠血清中SOD、AST、LDH活性的變化

由表3可知，與模型組相比，泊療組大鼠血清中SOD活性顯著升高(P<0.05)，AST和LDH活性顯著降低(P<0.05)；而與對照組相比，SOD、AST和LDH活性均差異不顯著(P>0.05)。

表3 五苓散治療后各組大鼠血清中SOD、AST、LDH活性變化

Table 3 The Changes of SOD， AST and LDH activeties in rat serum after Wuling San treatment U·L-1

2.5 肝、腎組織學檢查結果

通過HE染色觀察肝臟和腎臟組織的病理變化，結果顯示：對照組大鼠肝小葉、門靜脈等結構完整，呈現正常肝組織結構(圖1-A)；腎臟結構完整，無明顯病理變化(圖1-D)。模型組大鼠肝臟出現明顯的脂肪變性，存在炎性細胞浸潤及纖維增生，胞漿內有明顯的蛋白質顆粒，核固縮顯著，大部分肝小葉結構消失(圖1-B)；腎臟細胞出現空泡樣變性，部分細胞壞死、脫落，腎小管擴張，存在間質纖維化(圖1-E)。治療組大鼠肝臟存在輕微的脂肪變性，肝小葉結構完整(圖1-C)；腎臟少量細胞壞死、脫落，結構完整(圖1-F)。

3 討論

3.1 銅在動物體內的代謝及對機體的損傷

研究表明，從消化道攝入的銅在動物體內的吸收部位主要是十二指腸和小腸近端，部分銅的吸收也可發生在小腸遠端，一些通過膽汁排出的銅，經肝腸循環再回收利用進入血液后被運送到全身各處。銅被吸收后主要分布在肝臟、腎臟、腦、心臟、毛發中，而肝臟不僅是銅的貯庫，也是銅代謝的重要器官[5]。過量的銅集聚在肝細胞核、線粒體及肝漿液中，損傷這些亞細胞結構，抑制多種酶的活性，使谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、血漿精氨酸酶(ARG)及血漿膽紅素含量升高，導致肝功能障礙；當肝臟進一步受到損傷，銅就會被大量釋放入血，使血銅含量升高。血銅進入紅細胞，可使紅細胞脆性增加而發生血管內溶血，繼而導致貧血和血紅蛋白尿、紅細胞形態變化異常等。出現溶血時，腎銅濃度升高，腎小管被血紅蛋白阻塞，從而引起腎單位壞死、腎功能衰竭、血紅蛋白尿，甚至尿毒癥，嚴重者骨骼肌、中樞神經系統損傷[6]。本試驗結果顯示，模型組大鼠形體消瘦、被毛焦燥、顏色發黃；肝質脆、發黃、腫脹明顯，腎臟腫脹、呈巧克力色；SOD活性較對照組為低，AST、LDH則活性顯著升高。五苓散治療組大鼠肝臟略黃、腫脹不明顯，腎臟稍軟、略腫或不腫； SOD活性較對照組、模型組顯著上升，AST、LDH活性則顯著低于模型組，與對照組差異均不顯著。說明五苓散能有效緩解銅中毒引起的肝、腎損傷，對體內蓄積的銅有較好的排泄作用。

A、B、C，分別為對照組、模型組、五苓散治療組肝臟組織(HE染色，×40)；D、E、F，分別為對照組、模型組、五苓散治療組腎臟組織(HE染色，×200)A， B， C were live tissues in control group， model group and treatment group， respectively; D， E， F were kindney tissues in control group， model group and treatment group，respectively (HE ×200)圖1 大鼠肝臟和腎臟組織的病理學變化Fig.1 Pathological changes of liver and kidney tissues in rats

3.2 五苓散排銅的理論依據

中醫認為，銅中毒屬銅毒內蘊、濕熱火毒內擾之證。銅濁毒邪蓄積于肝腎，造成肝腎氣滯血結，脈絡壅塞，正氣耗傷，痰瘀留滯，水濕不化而成鼓脹[7]。源于東漢末年名醫張仲景《傷寒雜病論》的五苓散，為太陽病表里雙解法代表方之一，其組成為茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術(炒)，具有溫陽化氣、利濕行水之功效，可治療機體氣化不利、水飲內停等證；其在外可解表，在內健脾化氣利水，使人之水液代謝重歸平衡[8]?，F代藥理學研究表明，五苓散能利水利尿、保護腎肝[9-10]，可用于腎小球腎炎、肝硬化腹水、急慢性腎炎等見水腫、少尿者[11]。由此看來，五苓散對應的主證與銅中毒病機相吻合。

3.3 五苓散各組成藥味(茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術)的利尿保肝作用

茯苓，具有化濕利水、通調下焦水道的作用，其中的茯苓素因拮抗醛固酮而產生利尿作用，而茯苓多糖則能增強機體免疫力、保肝、促進造血等[12-13]；澤瀉，通小便、泄膀胱熱、調節機體水液代謝等作用顯著，其中的三萜類成分和澤瀉醇等有效成分不但具有利尿作用，而且還能有效改善肝功能[14]；豬苓，專功利水，可入下焦消除腫滿，與茯苓、澤瀉配伍時還能加強利水袪濕作用，其中的麥角甾醇及VB等有利尿作用，還能清除自由基、治療肝炎[15-16]；桂枝，具有溫通經脈，助陽化氣等功效，可輔肺臟行水、使膀胱通暢，其中的揮發油能通過促進SOD活性來抵抗脂質過氧化對機體的損傷[17]；白術，益氣健脾、燥濕利水，其中的揮發性成分蒼術酮通過抑制鈉鉀 ATP酶的活性發揮利尿作用，白術內酯則通過改善氧化應激造成的損傷以及調節炎性因子的水平來改善腎組織損傷，是白術中具有抑制炎癥反應的活性成分[18-19]?？梢?，五苓散中的諸多有效成分是通過利尿作用來加速體內銅的排泄，通過抗炎、抗氧化來保肝護腎，從而修復銅在體內蓄積而造成的損傷。

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(責任編輯 盧福莊)

Effect of Wuling San on copper poisoning in experimental rats

CHENG Yan1， LIU Yayun1， ZHANG Fangjie1， HUANG Cuihua1， KANG Youxi1， HAN Chunyang1， CHEN Dingding2，*， LIU Cuiyan1，*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China; 2.BiotechnologyCenter，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

In order to investigate the effects of Wuling San， a Chinese herbal medicine compound powder with promoting diuresis， on the copper excretion in animal， the pathological model of subchronic copper poisoning in SD rats was established by feeding high copper diet， and then Wuling San as a therapeutic drug was given by means of intragastric administration to rats. After the success of building models and at the end of treatment， the blood sample of rats was collected by cardiac puncture for determining copper content with the method of flame atomic absorption spectrometry， and the activities of serum AST， LDH and SOD were detected by reagent kit. At the end of the experiment， all the rats were anatomized to observe the changes of pathologic autopsy of the internal organs， and the histopathologic changes of liver and kidney. Results showed that compared with control group， the rats of the model group were slow in velocity of body weight increasement， the obvious pathological changes of liver and kidney structure were found and the level of blood copper was significantly higher (P<0.01)， indicating that the model of subchronic copper poisoning in rats was successfully established. After treated with Wuling San， compared with model group， the treatment group had less detectable changes in histopathology， the level of blood copper was significantly lower (P<0.05)， SOD activity increased (P<0.05) and AST and LDH activities declined (P<0.05). The above five indexes had no significant differences between the treatment group and the control group (P<0.05). The results of this study indicated that Wuling San could effectively promote the excretion of copper in rats， alleviate the damage of liver and kidney， so it could be used to treat clinical subchronic copper poisoning of animals.

Wuling San; rat; copper poisoning; therapy

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.05

2016-09-09

國家自然科學基金資助項目(31172358)；2015年國家級大學生創新訓練項目(201510364008)

程顏(1995—)，女，安徽宣城人，本科生，動物醫學專業。E-mail: 410150915@qq.com

*通信作者，陳玎玎，E-mail: dingding0626@126.com；劉翠艷，E-mail:cyliu@ahau.edu.cn

S853.91

A

1004-1524(2017)02-0206-07