環介導等溫擴增技術對錦鯉皰疹病毒的快速檢測

劉露

摘 要：為建立一種快速檢測錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）的環介導等溫擴增方法（LAMP），本研究根據GenBank中登錄的CyHV-3 TK基因編碼區序列設計了LAMP特異性引物，通過優化反應條件，建立了檢測CyHV-3的LAMP方法。表明本實驗建立的該檢測方法具有高靈敏度、高特異性、快速和簡便的特性，適用于臨床上對錦鯉皰疹病毒3的快速診斷。

關鍵詞：LAMP；CyHV-3；快速檢測

0 引言

錦鯉皰疹病毒病是由鯉皰疹病毒3型Cyprinid herpesvirus 3（CyHV-3）感染引起鯉魚、錦鯉以及普通變種鰓壞死和間質性腎炎的一種高致病性、高傳染性、高死亡率疾病。現已在全世界范圍內流行，嚴重威脅著鯉魚和錦鯉養殖業的發展。

目前，已經建立的對CyHV-3的檢測方法有DNA雜交、PCR、套式PCR、熒光定量PCR和環介導等溫擴增方法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）等。以上檢測方法在臨床檢測中均存在局限，如儀器設備，技術人員和成本等。LAMP檢測方法對儀器要求低，根據顏色變化通過肉眼可以對結果進行判斷，適用于現地檢測。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

含有CyHV-3 TK基因的重組質粒，Bst DNA聚合酶（長片段）、Thermopol II反應緩沖液，SYBR Green I熒光染料，Betaine，dNTP，DNAMarker，病毒DNA提取試劑盒，

1.2 引物設計

根據中華人民共和國水產行業標準中，鯉皰疹病毒檢測方法要求的CyHV-3的TK基因的序列，使用Primer Explorer V4設計8條特異性引物（表1），并交由上海生工合成。

1.3 LAMP擴增

LAMP反應體系：1μl F3/F3（10μM），1μl B3/B3（10μM），1μl FIP/FIP（50μM），1μl BIP/BIP（50μM），4μl dNTPs（25mM），4μl 10xThermopol buffer，8U BstDNA聚合酶，3μl Betaine（0.8M），2.5μl MgCl2（25mM），2μl模板DNA和4.5μl ddH2O，石蠟密封液面，之后加入2μlSYBR Green I，65℃孵育60min，80℃10min滅活酶終止反應。

反應管淡綠色為陽性，淡橘黃色為陰性。結果判定采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 LAMP反應條件優化

分別通過不同溫度以及不同時間進行LAMP擴增，優化dNTPs、Betaine、MgCl2等其他反應條件。

2 結果

LAMP的建立和檢測：以特異性引物對CyHV-3進行LAMP擴增，肉眼觀察，CyHV-3陽性管渾濁.而陰性管未見渾濁，加入熒光染料SYBR Green I后，CyHV-3陽性管反應液變為淡綠色，而陰性對照管為棕色。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，CyHV-3陽性管出現典型的梯形條帶，而陰性管沒有產生條帶。

經優化后，LAMP體系最佳反應時間為40min，最佳反應溫度為65℃，dNTPs最適濃度為1.2mM、Betaine最佳濃度為0.8mM、MgCl2最佳濃度為8mM。

3 討論

自從錦鯉皰疹病毒發現以來，各個地區幾乎每年都有流行。目前，錦鯉皰疹病毒病的全球性暴發，給錦鯉觀賞業、鯉魚養殖業以及國際貿易造成了嚴重的經濟損失。

PCR是目前較為精確檢測CyHV-3感染的方法。Bercovier等基于CyHV-3的胸苷激酶基因建立的PCR方法，能夠區分CyHV-3與CyHV-1和CCV。劉葒等建立了nestedPCR，已作為我國檢測CyHV-3的標準方法。范萬紅等建立的實時熒光定量PCR縮短了檢測時間，適用于進出口檢驗檢疫。LAMP法是一種新式恒溫核酸擴增方法，該擴增法具有簡便、快速、準確、廉價、易檢測等特點。Gunimaladevi等基于TK基因設計引物，建立了快速檢測CyHV-3的LAMP法。Soliman等在產物中加入SYBR GreenⅠ，根據其顏色的變化來判定結果，從而更加直觀。LAMP檢測法不需要特殊的儀器設備，適合現場診斷。因此LAMP法具有良好的應用前景。

本實驗建立的LAMP方法具有以下特點：第一速率快，僅40min左右即達到反應的平臺期；第二、對反應裝置要求較低，恒溫水浴鍋、PCR儀均能作為LAMP的恒溫反應裝置；第三、結果觀察簡單，添加SYBR Green I核酸染料后肉眼即可觀察。本文提供了穩定的CyHV-3檢測體系，為控制CyHV-3的流行與及時檢測提供了技術支持。

致謝

本研究由河北省研究生創新項目提供資金支持

參考文獻

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