β—欖香烯納米聚合物膠束包封率、載藥量及釋藥性測定

王靜 李學濤 袁子民

摘要：目的 建立β-欖香烯納米聚合物膠束包封率和載藥量的RP-HPLC測定方法，并對其釋藥性進行考察。方法 以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）為載體材料制備載藥膠束，采用石油醚萃取法測定包封率和載藥量，采用透析法對其釋藥性進行研究。結果 所制備的β-欖香烯納米聚合物膠束平均包封率為89.47%，平均載藥量為8.33%，體外釋藥緩慢。結論 包封率和載藥量的測定簡便、準確，所制得的膠束具有緩釋作用。

關鍵詞：β-欖香烯納米聚合物膠束；包封率；載藥量；釋藥性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.023

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0091-03

欖香烯是臨床常用的中藥廣譜抗腫瘤藥物，該藥及其脂質體注射液和口服乳制劑通過抗增殖和誘導凋亡作用，在體外及臨床用于腦膠質瘤治療方面取得了較好治療效果，但也存在一定不良反應[1-3]。β-欖香烯是由欖香烯經精餾后去除γ、δ-欖香烯異構體，得到的抗癌單體有效成分[4]。為增加β-欖香烯對血腦屏障的透過性及其載藥制劑在腫瘤組織的通透和滯留增強效應，本課題組以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）為載體材料，將其制成抗腦膠質瘤的新型腦靶向制劑，本研究對其包封率、載藥量進行測定，并考察其體外釋藥性，為進一步控制本品質量、優化制備工藝及其應用提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公

司），CENCO型渦旋儀（荷蘭Breda公司），RCZ-6B3型藥物溶出度儀（改裝為釋放溶出儀，上海黃海藥檢儀器有限公司），85-1型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（江蘇省金壇市友聯儀器研究所），透析袋（截留分子量8000～15 000，上海華藍生物科技有限公司），旋轉蒸發器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

β-欖香烯原料藥（含量>98%，自制），β-欖香烯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100268- 200401，供含量測定用），DSPE-PEG2000（上海艾韋特醫藥科技有限公司，批號20150922），甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 β-欖香烯納米聚合物膠束及空白膠束的制備

采用薄膜水化法制備。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000載體材料100 mg、β-欖香烯原料藥10 mg，置于茄形瓶中，加10 mL甲醇溶解，搖勻，于35 ℃旋轉蒸發真空干燥除去甲醇，在茄形瓶底部及內壁形成一層均勻的脂膜，加入pH 7.4磷酸鹽緩沖液5 mL，在40 ℃水浴中水化30 min，冷卻至室溫，經0.2 ?m聚碳酸酯膜過濾，即得透明的β-欖香烯納米聚合物膠束（β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs）[5-6]。同法制備不加β-欖香烯原料藥的空白膠束。

2.2 包封率和載藥量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilTM C18（5 μm， 200 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-水（95∶5），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取β-欖香烯對照品8.30 mg置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備及包封率、載藥量測定 精密量取β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs 1 mL置25 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得載藥膠束供試品溶液，測定膠束中總的藥物量（W1）。同法制成空白膠束對照溶液。另精密量取β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs 1 mL于5 mL離心管中，加入石油醚（30～60 ℃）3 mL，搖勻，渦旋3 min，靜置，待分層后，棄去石油醚層，同法重復萃取1次，除去未包封的游離β-欖香烯。將下層膠束加入適量甲醇溶解，轉移至25 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，測定石油醚萃取后包封的β-欖香烯藥物量（W2），計算包封率（EE），EE（%）=W2/W1×100%[5-6]。載藥量（DL）即膠束中單位質量的DSPE-PEG2000可以包封的藥物，DL（%）=W2/W×100%，W為DSPE-PEG2000加入量。

2.2.4 空白干擾試驗 精密吸取上述對照品溶液、載藥膠束供試品溶液、空白膠束溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，結果空白膠束對本品含量測定無干擾。色圖譜見圖1。

2.2.5 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL于10 mL量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=4.129 9X+6.902 1，r=0.999 8。結果β-欖香烯濃度在8.3～207.5 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一載藥膠束供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，記錄峰面積，結果表明，精密度良好，RSD=1.62%。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取同一載藥膠束供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄峰面積，結果β-欖香烯在10 h內保持穩定，RSD=1.72%。

2.2.8 重復性試驗 取同一載藥膠束樣品各6份，分別按載藥膠束供試品溶液制備方法操作，精密吸取各供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，測定。結果β-欖香烯平均含量為1.82 mg/mL，RSD=2.02%，表明重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 分別精密量取已知含量β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs溶液（1.82 mg/mL）0.5 mL共6份，置25 mL容量瓶中，分別精密加入β-欖香烯對照品溶液（0.83 mg/mL）1.0 mL，其余按載藥膠束供試品溶液制備方法及上述色譜條件測定并計算回收率，結果見表1，表明本法回收率良好。

2.3 體外釋藥研究

采用透析法考察載藥膠束的體外釋藥性。分別取載藥膠束溶液（1.82 mg/mL）及β-欖香烯原料藥溶液（1.80 mg/ mL）各2 mL，置預先處理好的透析袋中，兩端扎緊，固定于槳式攪拌器上，并將透析袋置于含pH 7.4磷酸鹽緩沖液（含0.5%十二烷基硫酸鈉）釋放介質50 mL的燒杯中，于（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振蕩（100 r/min），分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，并補充同溫等量釋放介質。平行操作3份。樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件，取濾液進樣20 μL測定，計算累積釋放率及3份樣品各點的平均值，并繪制釋藥曲線，結果見圖2。從圖2中可知，在pH 7.4磷酸鹽緩沖液釋放介質中，β-欖香烯原料藥溶液24 h內幾乎完全釋放，而載藥膠束僅釋放70%左右，且0～2 h屬于突釋，之后釋放緩慢，表明該膠束具有緩釋性能，利于使藥物到達病灶部位的靶組織[7-10]。

3 討論

膠束包封率測定方法主要有高速離心法、透析法、葡聚糖凝膠柱層析法等，但透析法、葡聚糖凝膠柱層析法時間較長、操作繁瑣，且β-欖香烯為揮發油，不溶于水，因此洗脫劑及透析介質很難選擇。另外，高速離心法對難溶于水的固體藥物較為適合，不適合相對密度小于水的β-欖香烯。因此，本試驗采用石油醚萃取法，除去未包封的游離藥物，方法簡便、快速、重復性好；同時對石油醚的萃取次數進行了考察，結果萃取2次基本提取完全。

體外釋藥研究多采用生物膜擴散、透析袋法等技術。本試驗采用透析法，該法簡單、易行。釋放介質選用與人體血漿pH值相近pH 7.4磷酸鹽緩沖液，為增加β-欖香烯在水中的溶解度及達到漏槽條件，在釋放介質中加入十二烷基硫酸鈉作為增溶劑。

為驗證β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs抗腦膠質瘤作用的靶向性，后續研究還需通過與原料藥注射液對照，結合細胞毒試驗、細胞凋亡試驗、細胞攝取試驗、動物體內的組織分布或活體成像技術驗證其抗腦膠質瘤的作用及靶向性。

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（收稿日期：2016-04-08）

（修回日期：2016-04-28；編輯：陳靜