補陽還五精簡方的體外篩選及體內驗證研究

張秀麗 孟盼 向韻 雷昌 劉芳 黃丹 蔡川 蔡光先 王宇紅

摘要：目的 篩選補陽還五精簡方的最佳配伍，并進行驗證。方法 采用H2O2誘導建立PC12細胞氧化應激模型。考察不同濃度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL補陽還五湯對體外氧化應激模型細胞的保護作用，確定最佳作用濃度。采用正交試驗設計，將補陽還五湯各單味藥隨機配伍分成補陽還五湯不同拆方組及對照組（僅加細胞培養基）、正常組（無H2O2和藥物處理）、模型組，考察對PC12細胞的保護作用，篩選精簡方，確定精簡方各單味藥的配伍比例，MTT法測定各組細胞存活率。采用大腦中動脈線栓法復制局灶性腦缺血模型，SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組和精簡方高、中、低劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃，驗證篩選結果。結果 與其他拆方組比較，黃芪+川芎+地龍對PC12細胞的保護作用最佳（P<0.05），且與補陽還五湯原方相當；與模型組比較，補陽還五湯組及精簡方各劑量組均能改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度（P<0.05），且以精簡方中劑量組最佳。結論 補陽還五精簡方最佳配伍為黃芪、川芎、地龍，其比例為10∶3∶1。

關鍵詞：補陽還五湯；拆方；局灶性腦缺血模型；氧化應激模型；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0049-06

中國腦卒中防治報告（2015）提示，腦卒中作為我國第1位死亡原因，其造成的經濟負擔每年高達400億元[1]。因此，如何有效防治腦卒中已成為當前醫學研究和臨床工作急需解決的難題和重要任務。臨床應用補陽還五湯治療缺血性中風及中風后遺癥療效較好。但其藥味眾多，藥效物質基礎難以明確。本實驗采用H2O2誘導的PC12細胞氧化應激模型，結合正交試驗設計對補陽還五湯進行體外拆方研究，篩選最佳精簡方，并采用永久性局灶性腦缺血（MCAO）模型，對篩選結果進行體內驗證。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

補陽還五湯（黃芪120 g，當歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和各單味藥及篩選獲得的精簡方干浸膏均由湖南省中醫藥研究院中藥所提供。補陽還五湯和精簡方干浸膏分別相當于原藥材4.5、4.7 g/g。所有藥物均采用無菌水溶解，配制成一定濃度的母液，0.25 μm濾膜過濾除菌，使用時無菌PBS稀釋至所需濃度。

1.2 細胞和動物

PC12細胞系（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞），高分化，長沙贏潤生物技術有限公司。SPF級10周齡SD大鼠40只，雄性，體質量250～280 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養于室溫（20±1）℃，濕度60%～70%，自由飲水進食，適應性喂養3 d后，進入實驗狀態。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養基（HyClone），胎牛血清（FBS，GIBCO），D-Hanks（Solarbio），胰蛋白酶（Solarbio），MTT（Sigma）。臺式低溫高速離心機（Eppendorf），超純水分離系統（ELGA），超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器有限公司），倒置顯微鏡（ZEISS），CO2培養箱（NEW BRUN-SWICK），多功能酶標儀（Thermo Scien Tific）。

2 實驗方法

2.1 PC12細胞培養及體外氧化應激細胞模型的建立

參照文獻[2]方法。將PC12細胞接種于TC處理的培養瓶，采用含10%胎牛血清DEME高糖培養基培養。37 ℃、5%CO2細胞培養箱中溫育，待細胞貼壁融合至90%時，0.25%胰蛋白酶消化，以1×104個/孔接種于96孔板，待細胞生長至對數生長期，替換為無血清培基繼續培養12 h，再用H2O2終濃度為0.3 mmol/L無血清培養液繼續培養2 h。

2.2 補陽還五湯拆方分組原則及對PC12模型細胞保護作用的考察

采用正交試驗設計，將補陽還五湯7個單味藥隨機配伍分成補陽還五全方組、黃芪+當歸+赤芍+川芎+紅花組、黃芪+當歸+桃仁+地龍組、黃芪+赤芍+桃仁組、黃芪+川芎+地龍組、黃芪+紅花組、當歸+紅花+桃仁組、當歸+川芎組、當歸+赤芍+地龍組、川芎+紅花+桃仁+地龍組、赤芍+紅花+地龍組、赤芍+川芎+桃仁組。補陽還五湯原方考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL，不同拆方中單味藥濃度按照補陽還五湯原方中單味藥比例進行確定。將細胞與藥物共同作用2 h，再加入H2O2繼續培育2 h。另設對照組（僅加細胞培養基）、正常組（無H2O2和藥物處理）、模型組（僅加H2O2處理）。MTT法測定細胞存活率[（OD值處理組―OD值空白對照組）÷（OD值正常組―OD值空白對照組）×100%]。

2.3 體內動物模型制備、分組、給藥及指標測定

采用大腦中動脈線栓法復制MCAO大鼠模型[3]。按體質量將大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組和精簡方高、中、低劑量組，每組10只。術后第1日開始給藥，補陽還五湯組給予補陽還五湯（相當于干浸膏3.15 g/kg），精簡方各劑量組給予低（干浸膏1.68 g/kg）、中（干浸膏2.41 g/kg）、高劑量（干浸膏3.44 g/kg）灌胃[4]。模型組和假手術組給予等量無菌蒸餾水。給藥體積均為0.05 mL/kg，每日1次。自由飲食、活動，連續給藥7 d后脫頸處死取材備用。

2.3.1 腦梗死面積比檢測 取大鼠腦組織-20 ℃冷凍20 min后去掉嗅球、小腦和腦干部分，取最大缺血斷面，即漏斗柄部位及后葉尾極之間的腦組織。腦片37 ℃避光、2%紅四氮唑染色30 min，正常組織呈深紅色，梗死組織則為白色。斷面拍照采用圖像分析系統進行掃描，計算腦梗死面積。腦梗死面積（%）=（健側總面積-患側非梗死區面積）÷2×健側總面積×100%。

2.3.2 腦干濕重比檢測 取大鼠腦組織，濾紙吸干其表面殘留血漬，置于小稱量瓶內稱取濕重，再將稱量瓶放入恒溫干燥箱內，105 ℃恒溫烤48～96 h至恒重（3次稱樣差別≤0.2 mg）。稱干重后，計算腦組織含水量。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）÷濕重×100%。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析，2組獨立樣本間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 不同濃度補陽還五湯原方對氧化應激模型細胞保護作用的影響

0.2 mg/mL補陽還五湯原方干預即可對抗H2O2的氧化損傷，對PC12細胞發揮保護作用，其細胞存活率均高于模型組（P<0.05）；在1 mg/mL范圍內，隨著藥物濃度升高細胞存活率增加，有效防止H2O2的過氧化；當藥物濃度繼續增大，則對細胞產生明顯的毒副作用，細胞存活率顯著降低，見圖1。因此，確定補陽還五湯原方對H2O2導致的過氧化損傷發揮保護作用的最佳作用濃度為1 mg/mL。

.3.1 各單味藥黃芪、川芎、地龍對模型細胞最佳保護作用濃度 根據補陽還五湯給藥后的實驗結果及預實驗摸索，我們設定單味藥黃芪考察濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，川芎和地龍的考察濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

在較高濃度（0.5～4.0 mg/mL）范圍內，黃芪濃度與模型細胞存活率呈正相關，對H2O2致損的PC12細胞發揮保護作用。由于2.0、4.0 mg/mL黃芪對模型細胞的保護作用差異無統計學意義，從節約資源和減輕對細胞毒副作用的角度，確定黃芪最佳給藥劑量為2.0 mg/mL。川芎和地龍則相反，在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內，細胞存活率明顯高于模型組，而更高濃度沒有保護作用，甚至產生毒副作用。見圖3。因此，川芎和地龍的最佳劑量均為0.2 mg/mL。

5 討論

補陽還五湯系清代醫家王清任創立的治療半身不遂辨證屬氣虛血瘀證的經典名方。本課題組前期大量研究表明，補陽還五湯能通過降低炎癥反應、促進神經干細胞增殖、調控caveolin-1、Toll樣受體等多種途徑有效防治腦缺血損傷[5-12]。但因其藥味眾多，藥效物質基礎難以闡明，不能完全滿足國際市場的標準，阻礙了其在國際市場上廣泛流通。

補陽還五湯重用生黃芪，大補元氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。配以當歸尾活血和血，且有化瘀不傷血之妙，是為臣藥。川芎、赤芍、桃仁、紅花助當歸尾活血祛瘀，地龍長于行散走竄、通經活絡，均為佐藥。各藥合用，使氣足以推動血行，瘀去絡通，則筋肉得養，痿廢可愈。本實驗運用反向藥理學方法，通過正交試驗研究了補陽還五湯及其不同拆方對PC12細胞氧化應激模型的的保護作用，結果發現，補陽還五湯原方與黃芪+川芎+地龍的配伍對PC12細胞的保護作用最好，正交直觀分析和方差分析亦顯示最佳配伍組合為黃芪+川芎+地龍，為精簡方的方藥配伍提供了實驗依據。

本研究考察了黃芪、川芎、地龍各單味藥對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激模型的保護作用，確定黃芪的最佳給藥劑量為2.0 mg/mL，川芎和地龍最佳作用劑量為0.2 mg/mL，驗證了中藥配伍中“重用君藥”的理論。黃芪、川芎、地龍兩兩配伍研究表明，最佳作用濃度的黃芪、川芎、地龍不同配伍組均能對模型細胞發揮保護作用；精簡方最佳配伍比例為黃芪∶川芎∶地龍=10∶3∶1。對PC12細胞的生物相容性的考察發現，精簡方組在24 h內細胞存活率遠高于100%，與PC12細胞的生物相容性非常好，為其臨床用藥的安全性提供了數據支持。

以MCAO模型大鼠為研究載體的體內實驗表明，補陽還五湯和精簡方中劑量改善模型大鼠大腦皮層梗死面積、降低腦組織水腫程度的作用最佳，且二者療效相當，進一步驗證了篩方結果。以上結果為進一步明確精簡方的藥效物質基礎與其藥物作用分子機制奠定了基礎。

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（收稿日期：2016-04-12）

4.2 補陽還五湯不同拆方對氧化應激模型細胞保護作用的影響

將10 mg補陽還五湯溶于10 mL PBS中，配制成1 mg/mL。按補陽還五湯原方配伍比例，確定10 mL拆方中黃芪為8.4 mg，當歸為0.4 mg，赤芍為0.3 mg，川芎、紅花、桃仁、地龍均為0.2 mg。MTT法觀察不同配伍對PC12細胞的保護作用，結果發現補陽還五湯原方與黃芪+川芎+地龍的配伍對PC12細胞的保護作用最佳，見圖2。將結果進行正交直觀分析和方差分析，表明精簡方最佳配伍組合為黃芪+川芎+地龍，見表1、表2。